ICS_11. 220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 544--2002 猪流行性腹泻诊断技术 Diagnostic techniques for porcine epidemic diarrhoea 行业标准信息服务平 2002-08-27 发布 2002~12-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T544—2002 前言 猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似,病毒形态上也基本相同,但两 者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。 本标准的附录 A、附录B、附录C均为规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。 本标准主要起草人：马思奇、王明、宣华、冯力、佟有恩。 行业标准信息服务平 NY/T 544-2002 猪流行性腹泻诊断技术 1范围 本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹 心酶联免疫吸附试验（ELISA），检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。 本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。 2 病毒分离与鉴定 2.1材料准备 2.1.1器材 倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。 2.1.2培养基及溶液的配制 磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞培养液、病毒培养液及N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)液（配 制方法见附录A)。 2.1.3细胞 Vero 细胞系。 2.2 病毒分离 2.2.1病料采集 采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。 2.2.2病料处理 将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素、PBS液制成5倍 悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22um微孔滤膜过滤，分装，一20℃保存 备用。 2.2.3接种及观察 将过滤液（病毒培养液的10%)接种于Vero细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃ 吸附1h，根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d4d，按致 细胞病变作用(CPE)变化情况，可盲传2代～3代。 2.3结果判定 CPE变化的特点是：细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞（7个～8个甚至几十个），并可见空斑样小 区,细胞逐渐脱落,这是特征性的 CPE,可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞 培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中 电镜观察可见到冠状病毒粒子。 息服务工 3直接荧光抗体法 3.1材料准备 3.1.1器材：荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。 3.1.2荧光抗体(FA)。 3.1.3溶液配制：磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油（配制方法见附录B）。 1