ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2417—2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法 Polymerase chain reaction (PCR) for detection of Haemophilusparasuis 行业标准信息服务平台 2013-09-10发布 2014-01-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2417—2013 前 言 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：逐忠新、贺英、储岳峰、赵萍、高鹏程。 行业标准信息服务平台 I NY/T 2417—2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法 1范围 本标准规定了检测副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）的聚合酶链式反应（Polymerase chainreaction,PCR)技术。 本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测。 2材料准备 2.1器材 PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2mLPCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、 电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。 2.2试剂 NET缓冲液（配制方法参见A.1）、TAE电泳缓冲液（配制方法参见A.2）、RNaseA酶、蛋白酶K、 TagDNA聚合酶（5U/μL）、10XPCR缓冲液（含Mg?+）、脱氧三磷酸核苷酸混合液（dNTPs，各 2.5mmol/uL）、125bpDNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿一异戊醇（25：24：1）、三羟甲基氨基 甲烷（Tris碱）、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、冰醋酸、氯化钠、漠酚蓝、溴化乙锭、十二烷基硫 酸钠(SDS)、灭菌超纯水。 2.3引物 引物序列:F1:5'-TATCGGGAG ATGAAA GAC-3';F2: 5'-GTA ATG TCT AAGGAC TAG-3'；Revx：5-CCTCGCGGCTTCGTC-3'。引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20μmol/L。 靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3。 2.4样品采集 2.4.1气管分泌物 用灭菌棉拭子蘸取气管分泌物，放入无菌试管中。 2. 4.2肺脏 无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品。 2.4.3关节液 若有关节囊肿，在囊肿部位表面常规碘消毒，用2mL或5mL灭菌注射器穿刺，无菌吸取1mL~ 息服务平台 2mL关节渗出液。 2.4.4采集的样品 应在4℃条件下立即送到实验室。 2.5DNA提取 2.5.1样品处理 2.5.1.1气管分泌物拭子 将每支拭子浸人1mL~2mLNET缓冲液中30min，反复挤压。将浸出液经4℃7500g离心 15min后，弃上清。收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬。 2.5.1.2肺组织 将肺组织样品剪碎，按1g加人0.9mLNET缓冲液研磨后，用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于 2mL灭菌离心管，4℃7500g离心15min，弃上清。收集沉淀，用1mLNET缓冲液重悬。 1