ICS65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2249—2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范 Technical specification of molecular detection for pineapple mealybug wilt pathogen 行业标准信息服务平台 2012-12-07发布 2013-03-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2249—2012 菠萝凋萎病病原分子检测技术规范 1范围 本标准规定了菠萝调萎病病原（包括菠萝萎伴随病毒和菠萝杆状病毒）的分子检测方法。 本标准适用于菠萝种苗及大田植株中菠萝调萎伴随病毒和菠萝杆状病毒的定性检测。 2规范性引用文件 本文作 因检验 SN/T1193 HING ON 3术语和定义 下列术语和定义 适用文本 件 3.1 S 菠萝凋萎病病原 pathogen of pineapple mealybug wilt(PMw) 包括菠萝调 和菠萝杆状病毒 iforn (Pineappleb 活菠萝调 号（PMWaV 1），菠萝调萎 病 害病原的分类地 位、寄主范围、危害症状及地 3.2 热休克蛋白 70 分子量约为 k的 及特定构象的维 持等起着重要作用 3.3 聚合酶链式反 应 模板基因序列分 在DNA聚合海作厂 下，根据模板序列设 用和适宜 计的两条引物分别与模板DNA两条 链上租 应的 段互补序列发生退火而互 吉合，接着在DNA聚合 物，使引物得以延伸，然后 酶的作用下以四种脱氧杉 东酸（dNT 断重复变性、退火和延伸这 一循环，使欲扩增的基因片段以儿何倍数扩增 3.4 逆转录聚合酶链式反应 reverse-transeriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR RT-PCR是先利用依赖于RNA的DNA聚合酶.将待测RNA逆转录为DNA：再以逆转录后的 段DNA作为模板，以模板DNA两端序列互补的一对特异性寡核苷酸序列作为引物，在四种脱氧核糖 核苷三磷酸存在下，利用依赖于DNA的DNA聚合酶的催化作用。经过数十次变性、退火和延伸的反 应循环，使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性的技术扩增，再通过电泳等手段检测到被 特异性扩增的片段。 3.5 tRNAm结合区 tRNAme是携带延长肽链上甲硫氨酸的tRNA，它负责识别延伸中AUG密码子。tRNAme结合区 NY/T2249—2012 为基因间隔区，该结合区为所有杆状病毒（Badnauirus）所共有。 4原理 根据PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的HSP-70特有碱基序列设计特异性引物进行RT- PCR扩增，依据是否分别扩增获得预期的590bp、611bp和499bp的DNA片段，判断样品中是否携带 菠萝凋萎伴随病毒：根据PBCoV的tRNAm结合区特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增，依据 是否扩增获得预期973bp的DNA片段，判断样品中是否携带菠萝杆状病毒。 5仪器设备、用具和试剂 按B.1和B.2的规定执行 6取样 ，取样量为1.0g~5.0g.实 以田间菠萝大苗木 直株或 芽 验室检测用样量为 检测方法 7. 1 PMWaV 7.1.1检测样品 RNA 取 RTPCR扩增。 参照附录 方法捷 检测样品和对照样品的总 RNA，超纯水作为空 B A 7. 1. 2 引物序列 R 引物序列 引物 正反义 LNEOT 检测病毒 BOCGCACAAACTTCAACCAATC PMWaV-1 PMWaV-1 PMWaV-1 GCACAACACTCAC 反义 PMWaV-2P ATCCACC ILIVY TACTAC 正文 PMWaV-2 PMWaV-2R CAT ACTCATACC PMWaV-3F 正义 PMWaV-3 AGYTOACTGTAGATTTCGA PMWaV-3R 7.1.3RT-PCR扩增反应 RT-PCR反应体系：首猪花叶病毒（AMV反转 专录酶反应缓冲液12. 分别加人10μmol/L的引 物PMWaV-1F、PMWaV R.PMWaV FPMW. 2R与PMW aV-3F、PMWaV-3R各1.5 μL,RNA1L.AMV反转录酶混合液1 L，加无RNA酶的超纯水至25μL。 RT-PCR反应条件：50℃C反转录30min:94C反应2min火活反转录酶，94℃30s，不同温度退火 （检测PMWaV-1退火温度为60℃，PMWaV-2和PMWaV-3退火温度为55℃）1min，72℃延伸1 min，30个循环：最后72C延伸7min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4C条件下保存， 存放时间不超过24h。 息服务平台 7.2PBCoV的PCR检测 7.2.1引物序列 PBCoV-F:5-AGAAAAGAGAATGAACAAAC-3 PBCoV-R:5'-AGTGATAAAGGGTCAAATAA-3 PCR片段长度为973bp。 2