ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1188—2006 水泡性口炎诊断技术 Diagnosis techniques for vesicular stomatitis 行业标准信息服务平台 2006-07-10发布 2006-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1188-—2006 前言 水泡性口炎(VS)是由弹状病毒科的水泡性口炎病毒(VSV)引起的马、牛和猪的一种水泡性疾病， 被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病,我国将其列为二类疫病。本病临床上与口蹄疫、猪水泡 病、猪水泡疹很难区别,主要表现为口唇部有水泡、溃疡、糜烂,影响采食,导致生长缓慢,影响经济效益。 OIE采用组织细胞、鸡胚、实验动物等方法分离水泡性口炎病毒,进一步用间接夹心酶联免疫吸附 试验(IS-ELISA)和补体结合试验(CF)对分离的病毒进行鉴定；在国际贸易中,OIE指定用液相阻断酶 联免疫吸附试验(LP-ELISA)、病毒中和试验(VN)和补体结合试验(CF)检测水泡性口炎血清样品。 本标准中水泡性口炎的病毒分离试验、IS-ELISA试验和病毒中和试验，是根据OIE《哺乳动物、 禽、蜜蜂A和B类疾病诊断实验和疫苗标准手册》(2000版)中的诊断技术以及国内近年来在水泡性口 件等效。 本标准的附录 A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部动物检疫所。 本标准主要起草人：李其平、龚振华、陆明哲、郑增忍、郭福生、蒋正军、王海霞。 行业标准信息服务平台 I NY/T 1188—2006 水泡性口炎诊断技术 1范围 本标准规定了水泡性口炎(VS)的病毒分离鉴定试验、间接夹心酶联免疫吸附试验(IS-ELISA)和 病毒中和试验(VN)的技术要求。 本标准适用于水泡性口炎流行病学调查、临床诊断和实验室检测等。 2 病原分离与鉴定 2.1病原分离 2.1.1器材 100mL玻璃细胞培养瓶，恒温水浴箱，CO2培养箱，超净工作台，倒置显微镜。 2.1.2试剂及溶液配制 MEM营养液,PBS缓冲液，牛血清,7.5%碳酸氢钠溶液，青霉素(104TU/mL)与链霉素(104mg/ mL)溶液,3%的谷氨酰胺溶液,Hanks液,灭菌生理盐水,0.25%胰蛋白酶溶液,缓冲甘油(pH7.2~ 7.7),配制方法见附录A。 2.1.3样品的采集 2.1.3.1采集发病动物口鼻部位的水泡皮和水泡液，水泡皮加人含50%甘油的PBS缓冲液中，水泡液 置于含2%犊牛血清和5%葡萄糖的灭菌生理盐水中,冷藏送检。保存液的体积不能超过水泡皮或水泡 液体积的2倍。 2.1.3.2不能获得水泡皮和水泡液时，牛可用探杯采集食道/咽(OP)黏液，猪可采集咽喉拭子，置于无 血清的细胞培养液中,冷藏送检。无血清细胞培养液的体积不能超过黏液或咽喉拭子的2倍。 2.1.4样品的处理 IU/mL、链霉素1000mg/mL),4℃浸渍16h～20h,以3000r/min离心15min，取上清液，用0.2μm微 孔滤膜过滤。 2.1.4.2将水泡液、OP液、棉拭子浸液加青霉素至1000IU/mL、链霉素至1000mg/mL,离心,取上清 液，用0.2μm微孔滤膜过滤。 2.1.5细胞接种 2.1.5.1将2.1.4的样品1mL接种长成单层的VERO细胞、BHK-21细胞或IB-RS-2细胞,37℃吸 附 1 h,中间摇动一次。 2.1.5.2加人9mL维持液,37℃、5%C0培养箱中培养。 2.1.5.3每天观察细胞病变效应(CPE),连续观察3天。 2.1.5.4如果细胞出现圆缩、聚集、固缩、脱落等病变，则进一步按方法2.2进行病原鉴定。盲传3代 无病变者按2.1.8处理。 2.1.6 鸡胚接种 2.1.6.1将鸡胚卵置于蛋架上，气室朝上，以碘酒、酒精棉球消毒气室，用剪刀去除气室部蛋壳。 2.1.6.2用无菌眼科镊子撕去一小片内壳膜，在绒毛尿囊膜上滴人2.1.4中的样品0.2mL。 2.1.6.3用无菌脱脂棉撕成薄片盖住蛋壳，用蜡封口，于37℃孵育。 1