ICS 11.220 CCS C 30 中华人民共和国国家标准 GB/T 41522—2022 三种犬病病毒基因芯片检测方法 Method of DNA microarray for detection of three canine viruses 2022-07-11实施 2022-07-11发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41522—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国生物芯片标准化技术委员会（SAC/TC421)归口。 本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、博奥生物集团有限公司、北京农学院、上海海关动植 物与食品检验检疫技术中心。 本文件主要起草人：汪琳、高志强、尹羿、赵相鹏、任彤、蒲静、方雪恩、张伟、赖平安、蒋迪、刘凤风华、 薛俊欣、李健、卢先东、刘艳红。 1 GB/T41522—2022 三种犬病病毒基因芯片检测方法 1范围 本文件描述了同时检测三种犬病病毒（CDV、CPV和CAV-1)的微阵列基因芯片检测方法和微流 控芯片检测方法 本文件适用于待测对象鼻拭子、粪拭子、血浆、血清及脏器肌肉组织等样品中三种病毒核酸的同时 快速检测 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T 6682 2分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T40458—2021用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin） CAV-1:犬1型腺病毒（Canineadenovirus-1) cDNA:互补 DNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid) CDV：犬瘟热病毒（CanineDistempervirus） CPV：犬细小病毒（CanineParvovirus） DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate) DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid) dNTPs：核苷三磷酸（NucleosideTriphosphate） DMSO：二甲基亚矾（Dimethyl Sulfoxide) DTT：二硫苏糖醇(Dithiothreitol) EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) PBS：磷酸缓冲盐溶液（PhosphateBufferedSaline） PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction） RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid） 1 GB/T41522—2022 RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease） Rnasin：核糖核酸酶抑制剂（RibonucleaseInhibitor） RT-PCR：反转录-聚合酶链反应(ReverseTranscriptionPolymerase ChainReaction) SDS：十二烷基磺酸钠（SodiumDodecylSulfate） SSC：柠檬酸钠缓冲液（CitricacdSodiumCitrateBuffer) Taq酶：Taq聚合酶（ThermusAquaticus） Tris-HCL：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（TRISHydrochloride） 5原理 在序列比对基础上，分别针对CDV、CPV和CAV-1保守区设计合成引物和探针。 对于三种犬病病毒的微阵列基因芯片检测方法，用点样仪将长度为20nt左右的寡核苷酸探针，点 制在醛基化玻璃基片上。对待检样品进行检测时，先用引物将样品中存在的病毒核酸保守区扩增出来， 再通过标记PCR将荧光染料Cy-3或Cy-5标记在扩增产物上，当扩增产物与芯片杂交后，杂交位点就 会发出荧光信号，通过芯片扫描仪捕获荧光信号，从而确定样品中是否含有这三种犬病病毒核酸。 对于三种犬病病毒的微流控芯片检测方法，将引物分别固定在微流控芯片相应位置后，对微流控芯 片进行封装，将提取的核酸模板与反应液（包含荧光物质）混合反应后，加入封装好的微流控芯片中，之 后放入带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进 入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有自的片段，则能够得到恒温扩增，扩增产物与荧光 物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧光信 号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有相应的病毒核酸 6 仪器与材料 6.1 仪器 6.1.1芯片点样仪。 6.1.2芯片扫描仪 6.1.3微流控芯片检测仪。 6.1.4 PCR仪。 6.1.5 纯水仪。 6.1.6芯片杂交盒 6.1.7 高速微型离心机（离心速度12000r/min以上）。 6.1.8 台式高速离心机（离心速度3000r/min以上）。 6.1.9 旋涡振荡仪。 6.1.10 恒温干燥箱。 6.1.11 旋涡振荡仪。 6.1.12 微量点样仪。 6.1.13 低温冰箱。 6.1.14 微量进样器（0.5μL、2μL、10μL、100μL、1000μL）。 6.2 试剂和耗材 6.2.1总则：除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，水为按照GB/T6682规定的三级水，所有 试剂均用无RNase污染的容器分装。 2 GB/T 41522—2022 6.2.2阴性对照、阳性对照和微流控芯片内参对照的成分如下。 阴性对照：无RNase水。 阳性对照：从阳性样本中提取的核酸，或人工合成的含有目标核酸序列的DNA片段。 内参对照：包括扩增内参基因片段的引物和人工合成的内参质粒，其中引物固定于微流控芯片 反应孔中，内参质粒存在于反应液中。 6.2.3PBS（应符合附录A的规定）：121℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加人青霉素、链霉素 各10000U/mL。 6.2.4核酸裂解液：100mmol/LTris-HCL,50mmol/LEDTA,0.5%SDS,5mol/L盐酸胍,5mol/L 尿素，1%吐温-20。 6.2.5核酸提取试剂：包含蛋白酶（20mg/mL）、磁珠（50mg/mL）、裂解液、异丙醇、洗液一、洗液二、洗 液三和洗脱液等。也可以使用其他等效核酸提取试剂或者将DNA或RNA分别提取的试剂。 6.2.7微阵列芯片检测缓冲液配制、引物、探针序列、反应液体系、杂交液体系组成、芯片制作及使用注 意事项应符合附录A和附录B中表B.1～表B.3的规定。 8mmol/LMgSO,,0.1%吐温-20,1.4mmol/LdNTPs;Bst酶.800U/mL;50μmol/LSYBRGreen荧 光染料；内参质粒（4o0copies/μL）；反转录酶，4oU/μL；Rnasin，0.8U/μL。 6.2.9微流控芯片：5μL/反应池，8样本的离心微流控芯片。CPV、CDV和CAV-1引物应符合附录C 中表C.2表C.4的规定。微流控芯片试剂组分和存放条件应符合表C.1的规定。微流控芯片制作与 质量控制相关示例见附录D。 6.2.10耗材：微阵列芯片、微流控芯片、封口膜、磁珠、无RNase吸头（10μL、100uL、1000uL）、无 RNase离心管(1.5mL、2mL)等。 7试验方法 7.1样品 7.1.1通用要求 所有测试样品的采集、保存和运输应按照GB/T27401的规定执行。 7.1.2采样工具 下列采样工具应经121℃、15min高压灭菌并烘干：棉子、剪刀、镊子、注射器、1.5mL离心管、研 钵等。 7.1.3样品的采集 7.1.3.1活动物 取鼻拭子和粪拭子，采集方法如下： 取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，粘取鼻腔分泌液； 取粪拭子时将拭子深入肛门旋转一圈并沾取少量粪便。 将采样后的拭子分别放人盛有1.0mLPBS的1.5mL离心管中，加盖、编号。 7.1.3.2脏器和肌肉组织 用无菌剪刀、镊子采集病死动物实质脏器和肌肉组织，装入一次性无菌样品袋或其他火菌容器 3