ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T35332—2017 葡萄A病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Grapevine virus A 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35332—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、福建省农业科学院、中华人民共和国江苏出人境检验 检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张永江、谢丽雪、李彬、魏梅生、李桂芬、马洁、辛言言、张晓雷、吴兴海、朱水芳 GB/T35332—2017 葡萄A病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了葡萄A病毒（GrapevinevirusA）的检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带葡萄A病毒的葡萄苗木、接穗、砧木、插条等繁殖材料的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 葡萄A病毒基本信息 3 学名：Grapevine virus A。 缩写：GVA。 异名：葡萄茎痘相关病毒（Grapevinestempitting-associatedvirus） 分类地位：β线形病毒科（Betafleriviridae），葡萄病毒属（Vitiuirus）。 GVA的其他信息参见附录A。 方法原理 4 GVA的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据GVA与抗体之间的特异性反应，对植 物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)和免疫电镜检测；依据GVA的基因组特征建 立RT-PCR、实时荧光RT-PCR；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有GVA。 51 仪器、用具及试剂 5.1仪器 冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、PH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 成像分析仪、酶标仪、透射电子显微镜。 5.2用具 酶联板、可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)和可调移液器头、离心管、研 钵、微型磨杆等。 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。DAS-ELISA试剂 1 GB/T353322017 SN/T 1840. 6样品制备 将葡萄种苗种植于隔离温室中，在生长期间进行严格的症状检查。对可疑症状的植株，采基部发育 良好具症状的叶片1g单独制样，用于后续检测；无明显症状的，可5株混合采样用于后续检测 7检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染GVA的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作 为空白对照；其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致 具体操作见附录B。 7.2免疫电镜检测 免疫电镜检测方法见SN/T1840。 7.3 3RT-PCR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总 RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C。 7.4实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品 和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D。如采用商品化 一 步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 8结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： 采用DAS-ELISA或免疫电镜方法进行检测，若： 检测结果为阳性时： RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带GVA； 或用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带GVA。 检测结果为阴性时： RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带GVA；检测结果为阳性，则对产物进行测序， 测定的序列为GVA序列，则判定样品携带GVA； 或用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阴性，则判定样品不携带GVA；若检测结果 为阳性，则判定样品携带GVA。 2 GB/T35332—2017 9 样品保存与结果记录 9.1 样品保存 经检测确定携带GVA的样品应保存在适合的条件下以备复核。活体的病株在隔离温室中保存， 其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80℃冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年。 9.2 2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值；免疫电镜检测应有电镜图片；RT-PCR检测应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测应有荧 光曲线图。 3