ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34740—2017 动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法 Diagnostic methods for animal rabies diagnosis with direct immunofluorescence assay 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34740—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准参考世界动物卫生组织（OIE)2013年版《陆生动物卫生手册》2.1.13狂犬病的相关内容 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所。 本标准起草人：扈荣良、张守峰、刘哗、张菲、连海。 1 GB/T 34740—2017 动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法 1 范围 本标准规定了动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法的材料和试剂、器械和设备、防护措施、动物脑组 织样品采集、运输和保存、实验操作及镜检观察与结果判定。 本标准适用于动物狂犬病的病原学诊断。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DFA：直接免疫荧光检测（DirectImmunofluorescenceAssay） FITC：异硫氰酸荧光素（FluoresceinIsothiocyanate) PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-BufferedSaline) 4 材料和试剂 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1水GB/T6682—2008，二级水。 4.2狂犬病阳性对照脑组织（见A.1)。 4.3狂犬病阴性对照脑组织（见A.2)。 多克隆抗体制备而成，用PBS(0.01mol/L，pH7.4，见B.1)稀释成工作液，现用现配 4.51%伊文思蓝溶液（见B.2）。 4.6 固定液（80%丙酮溶液，见B.3）。 警示——丙酮易燃，有害健康！ 4.7 PBS(0.01 mol/L,pH 7.4,见 B.1)。 4.8 80%碱性缓冲甘油溶液（见B.4）。 5 器材和设备 5.1 检采样及防护器材 手术刀、剪刀、钳、镊、乳胶手套、护目镜。 1 GB/T347402017 5.2 样品保存及冷冻设备 无菌螺口带盖离心管、一20℃以下冰箱 5.3 3样品消毒设备 高压灭菌器。 5.4 4检测设备和器材 倒置荧光显微镜、37℃加湿培养箱、移液器及吸头、载玻片、盖玻片、染色缸、湿盒、吸水纸 6 防护措施 样品采集人员应采取相应的个人防护措施及实验操作过程中污染物品的处理（见附录C）。 7动物脑组织样品的采集、运输和保存 7.1采集 7.1.1采集部位 用于检测的脑组织应包含脑干、小脑和海马角 7.1.2小动物脑组织的采集 鼠、免等小动物可打开颅腔，采集全部脑组织。 7.1.3中、大动物脑组织的采集 犬等中、大动物通常可通过枕骨大孔采样法，采集部分脑组织用于本检测：用一直径5mm饮料吸 管或一个2mL一次性塑料移液管，朝一侧眼晴方向插人枕骨大孔，抵最深处后捏紧或堵住外口，小心 抽出，管内脑组织即包含延髓、小脑基底部、海马角、大脑髓质和皮质等部位。 7.2 运输 样品装人无菌螺口带盖离心管，密封包装后，4℃以下冷藏或冷冻运输。样品运输应使用双层密封 包装。在无法保证冷藏运输时，可将脑组织保存在含50%甘油的PBS（见B.1)中，但仍应尽可能低温 运输。 7.3保存 在无菌螺口带盖离心管内，于一20℃以下保存。 8实验操作 8.1月 脑组织触片制备 在Ⅱ级生物安全柜中取小脑、脑干、海马角、大脑髓质和皮质等部位各米粒大小的待检组织，每个部 位分别在同一载玻片不同位置上轻触，形成明显的印记，倒放在吸水纸上轻压吸去多余液体。同时制备 已知阴、阳性脑组织触片。将触片在生物安全柜内室温干燥10min。 2 GB/T34740—2017 8.2触片固定 警示一丙酮易燃，有害健康！ 干燥后的触片置于载玻片架上，浸人冷的80%丙酮（见B.3）内固定30min。室温自然干燥 10 min。 8.3荧光抗体染色、浸洗及封片 8.3.1以PBS(0.01mol/L，pH7.4，见B.1)稀释荧光抗体至工作浓度，加终浓度0.002%的伊文思蓝 （见B.2），混匀后吸取约200uL滴加于组织触片表面。 8.3.2将载玻片放入湿盒，在37℃温箱内温育1h。 8.3.3弃去载玻片上的染色液，于PBS浸洗2次，每次3min。 8.3.4以吸水纸小心吸去玻片边缘多余液体，样品表面滴加1滴（约30μL）80%碱性缓冲甘油溶液 （见B.4），加盖玻片，于1h内在暗室中荧光显微镜下观察。 9镜检观察与结果判定 9.1镜检操作 荧光显微镜下判定检测结果。应使用200倍放大倍数观察。在对样品观察结果作出阴性结论前， 每张触片应至少读取40个不同的视野。 9.2染色强度及病毒抗原分布判定 9.2.1荧光显微镜下的特异性荧光为大小不等的亮绿色尘埃样颗粒或稍大的团块，有时沿神经纤维走 行，呈条索状分布。阳性样品应呈明亮的苹果绿色，组织炎性分泌物或腐败产物可导致荧光强度减弱。 9.2.2脑组织样品中的病毒抗原分布对应的染色强度分为4个等级，分别记为十、十十、十十十、十十 十十，无特异性荧光颗粒时记为二”。 9.2.3十十十十：样品的每个视野内几乎都有大量的不同大小和形状的特异性荧光颗粒。 9.2.4十十十：样品的绝大多数视野内都有不同大小和形状的特异性荧光颗粒，数量不等 9.2.5+十：10%～50%的视野内可见形状、大小不等的特异性荧光颗粒，且荧光颗粒数量较少。 9.2.6十：<10%的视野内可见形状、大小不等的特异性荧光颗粒，且荧光颗粒稀少。 9.2.7一：各视野均无特异性荧光颗粒出现。 9.3 结果判定 9.3.1阳性对照触片的抗原分布应判定为十十十～十十十十，阴性触片应判定为一，作为对照成立的 标准。 9.3.2在对照成立的基础上，对待检样品进行判定。待检样品着染强度为明亮或明显的苹果绿色，抗 原染色判定为十十～十十十十时判定为狂犬病感染阳性；十判定为狂犬病感染可疑；无特异性荧光染色 的样品判定为阴性。 9.3.3可疑阳性样品应取多部位脑组织样品复检，复检仍为可疑的，判为阳性。 3