ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 34729—2017 猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法 Blocking ELiSA method to detect antibody against classical swine fever virus 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34729—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人：王琴、徐璐、范学政、赵启祖、朱元源、邹兴启、宁宜宝 1 GB/T34729—2017 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及4.1与猪瘟病毒E2蛋白表达及纯化相 关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 系方式获得： 专利持有人姓名：中国兽医药品监察所 地址：北京中关村南大街8号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 GB/T 34729—2017 猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法 1范围 本标准规定了猪瘟病毒抗体检测的阻断ELISA方法 本标准适用于猪瘟抗体检测，但无法区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 兽医实验室生物安全技术管理规范 农业部公告第302号 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CSFV:猪瘟病毒（Classical SwineFeverVirus) ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay) HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase） OD：光密度（OpticalDensity） 4 试剂 4.1 猪瘟病毒E2蛋白：见附录A。 4.2 酶结合物：参见附录B。 4.3 标准阳性血清：猪瘟疫苗免疫仔猪制备，经荧光抗体病毒中和试验检测为阳性。 4.4 标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪瘟疫苗的仔猪血清，经荧光抗体病毒中和试验检测为阴性。 4.5 包被液：见C.1。 4.6 磷酸盐缓冲液：见C.2。 4.7 封闭液：见C.3。 4.8 20倍浓缩洗液：见C.4。 4.9 稀释液：见C.5。 4.10 底物液A：见C.6。 4.11 底物液B:见C.7。 4.11 终止液见C.8。 4.12 商品化试剂盒：可选择同类的商品化试剂盒。 5 器材和设备 5.137℃温箱。 1 GB/T34729—2017 5.2 2酶联读数仪。 5.3微量移液器（200μL、1000μL）和吸头。 5.4多道移液器（200μL）。 5.5酶联反应板。 5.6一次性注射器（5mL、10mL)。 6血清样本的处理 6.1样本采集及处理 采集静脉血时，每头猪使用一个注射器，不同猪的注射器不能混用。进行前腔静脉或耳静脉无菌采 血，不少于2mL。室温静置于斜面2h，待自然凝固后，置于2℃～8℃冰箱中放置不少于2h，4000r/min 离心10min。用移液器小心吸出上层血清。 6.2血清样本的存放与运送 血清样本在一周内检测，可置2℃～8℃条件下保存，超过一周，应置一20℃以下冷冻保存。运输 时注意冷藏，确保样品有效。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时间应尽量 缩短。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识 7检测步骤 7.1抗原包被：用包被液将亲和层析纯化的E2蛋白稀释至0.2ug/mL，包被酶联反应板，100μL/孔， 2℃～8℃包被16h，即为抗原包被板。 新鲜配制的封闭液300L，2℃8℃封闭24h。封闭结束后，弃去孔中液体，每孔加人1倍洗液 300μL，漂洗1次，于吸水滤纸上拍干。 7.3在抗原包被板中加入稀释液，50μL/孔。将待检血清按顺序加人到抗原包被板中，50μL/孔。同 时加入阳性对照及阴性对照血清各2孔，50uL/孔。37℃温箱中反应1h， 7.4弃去反应液，每孔加人1×洗液300μL，漂洗3次。 7.5用稀释液将酶结合物稀释100倍，每孔加人100μL。37℃温箱中反应1h。 7.6重复 7.4步骤。 10 min。 7.8每孔加人100μL终止液 7.9酶标仪上读取450nm吸光值。 7.10结果计算[见式（1)～式（3)]： (1) 2 式中： N—阴性对照孔平均值； N,一阴性对照孔1的OD值； N 阴性对照孔2的OD值。 (2 ) 2 2