ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 30945—2014 饲料中泰乐菌素的测定 高效液相色谱法 Determination of tylosin in feeds- High performance liquid chromatography 2014-07-08发布 2015-01-08实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T30945—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（西安）。 本标准主要起草人：张眉、贾青、李会玲、冯西辉、王均良、郭洁、李胜。 GB/T30945—2014 饲料中泰乐菌素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了以高效液相色谱（HPLC)仪测定饲料中泰乐菌素的方法 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中泰乐菌素的测定，本方法定量限 为l mg/kg。 本标准不适用于添加尿素的饲料。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样中的泰乐菌素经二氯甲烷提取后，过滤，滤液经HLB小柱净化、浓缩，注人高效液相色谱仪进 行分离，用紫外检测器检测，外标法定量。 4试剂和材料 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂，用水符合GB/T6682中一级用水的规定。 4.1 甲醇。 4.2 乙睛：色谱纯。 4.3 甲醇：色谱纯。 4.4 二氯甲烷。 4.5 正已烷。 4.6 氨水。 4.7 乙腈溶液（50%）：取乙睛（4.2）100mL与100mL水混合。 4.8 盐酸溶液（1mol/L）：取9mL盐酸于100mL容量瓶中用水稀释并定容。 4.9 泰乐菌素标准品：纯度≥98%。 4.10 0.005mol/L磷酸二氢铵缓冲液：准确称取0.5751g磷酸二氢铵于1000mL容量瓶中，加水溶 解并定容，过0.45um滤膜。 4.11淋洗液：含2%氨水5%甲醇的水溶液，吸取2mL氨水（4.6）、5mL甲醇（4.1），用水稀释至 100 mL. 1 GB/T30945—2014 水，使溶解，用1mol/L的盐酸溶液（4.8）调节pH至5.5，用水定容 4.13HLB固相萃取小柱²（200mg，3mL）。 4.14泰乐菌素标准储备液：精密称定泰乐菌素标准品100mg（精确到0.01mg），于100mL容量瓶中， 加入50%乙睛（4.7）溶液使溶解，并定容，该溶液浓度为1mg/mL，置4℃冰箱中保存，该溶液有效期为 3个月。 4.15泰乐菌素标准系列：分别吸取一定量的标准储备液（4.14），置于10mL容量瓶中，用乙睛（4.2）稀 释、定容，配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0μg/mL的标准工作液。 5仪器设备 5.1 高效液相色谱仪（配紫外检测器）。 5.2# 振荡器。 5.3天平：精度为0.01g和0.00001g。 5.4 固相萃取装置。 5.5 超纯水处理器。 5.6 氮吹仪。 5.7 真空泵。 5.8 高速离心机。 5.9 旋转蒸发仪。 5.10 真空抽滤装置 5.11 0.45μm微孔滤膜。 6试样的制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备。粉碎过0.45mm孔筛，混 合均匀，装人密闭容器，低温保存备用。 7分析步骤 7.1样品处理 7.1.1提取 准确称取2g～3g饲料样品（精确至0.01g），置于100mL具塞三角瓶中，加入25mL二氯甲烷 （4.4）于振荡器上振荡提取20min，用快速滤纸过滤，收集全部滤液于梨形瓶中，在45℃下于旋转蒸发 仪上蒸干溶剂，加0.5mL甲醇（4.1)溶解残渣，再加人pH=5.5的乙酸钠缓冲溶液（4.12）4.5mL，轻轻 中。在离心管中加入5mL正已烷（4.5），轻轻摇动离心管，防止乳化，于4000r/min离心5min，使分 层，弃去正已烷层，下层水相层备用。 7.1.2净化 1）Oasis?HLB固相萃取小柱是由WatersCorperation（34MaplestreetMilfordMA.USA）提供的产品的商品名 称，给出这一信息是为了给本标准使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。 2 GB/T30945—2014 层加人小柱，让溶液自然流下，分别用5mL水和5mL淋洗液（4.11）淋洗，待淋洗液全部流出，抽干 HLB小柱中的液体，用5mL甲醇（4.3）洗脱，收集洗脱液于试管中，在氮气流下吹干，用1mL乙睛 （4.2）溶解残渣，过0.45μm滤膜，上机测定。 7.2测定 7.2.1 色谱条件 色谱条件如下： 流动相：乙腈：甲醇：0.005mol/L磷酸二氢铵（4.10）=50：35：15。 b) 流速：0.6mL/min。 c) 柱温：25℃。 d) 检测器：紫外检测器。 e) 检测波长：290nm。 f) 色谱柱：symmetryshieldRP182），柱长250mm，内径3.9mm，或性能类似的色谱柱。 g) 进样体积：20μL。 7.2.2 定量测定 分别取样品试液（7.1.2)和相应浓度的泰乐菌素标准工作液（4.15）按7.2.1的条件进行分析，以外标 法做单点或多点校正，以保留时间定性，峰面积定量，泰乐菌素标准溶液的色谱图参见附录A。 8结果计算及表示 8.1结果计算 PXcsXVX1000 .(1) PsXmX1 000 式中： P 试样溶液中泰乐菌素的峰面积； cs 标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V 试样定容体积，单位为毫升（mL）； Ps 标准溶液中泰乐菌素的峰面积； 试样质量，单位为克（g）。 m 8.2 结果表示 测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。 9重复性 同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于10%。 称，给出这一信息是为了给本标准使用者提供方便，而不是标准主管部门对这一产品的认可。