ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 31802—2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Tomato spotted wilt virus 2015-07-03发布 2015-11-20实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31802—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李桂芬、鲁洁、马洁、孔君、王秀芬、杜智欣、张永江、魏梅生。 I GB/T 31802—2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中番茄斑萎病毒的检疫鉴定方法。 本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3仪器设备及试剂 3.1 仪器设备 酶标仪、天平（感量1/10000g）、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。 微量移液器（2μL,10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌 土等。 3.2试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C,实时荧光RT-PCR检测试剂见 附录D，生物学测定试剂参见附录E。 4抽样与样品制备 4.1抽样 抽样按照SN/T2122的规定进行。 4.2种子样品制备 将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于25℃生长并进行症状观察。待长出3片～ 4片叶后，将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为一组）并编号。采集叶片用于酶联免疫 测定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定。 4.3苗木样品制备 将苗木种植于隔离温室中，于25℃生长并进行症状观察。有症状的苗未单独检测。没有症状的分 组检测，分组方法和检测方法同4.2。 1 GB/T31802—2015 检疫鉴定方法 5.1酉 酶联免疫吸附测定 见附录B。 5.2 RT-PCR检测 见附录C。 5.3 实时荧光RT-PCR检测 见附录 D。 5.4 生物学测定 参见附录E。 6 结果判定 样品经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性，判断待 检样品不携带番茄斑萎病毒。 样品经酶联免疫吸附测定为阳性，RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性，即可判断待检 样品携带番茄斑萎病毒。必要时可进行生物学测定。 7样品保存与结果记录 7.1 样品保存 经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存，种子可在4℃保存1年，病株可在 一20℃或一80℃冰箱中保存1年，做好标记和登记工作。 7.2 结果记录 完整的记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并应有经手人和实验 人员的签字。酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光 RT-PCR应有反应原始数据，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。 N GB/T31802—2015 附录A （资料性附录） 番茄斑萎病毒相关资料 A.1背景资料 A.1.1 基本信息 番茄斑菱病毒学名：Tomatospottedwiltvirus，缩写：TSWV。 分类地位：布尼亚病毒科（Bunyauiridae），番茄斑萎病毒属（Tospouirus）。 A.1.2方法原理 列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸的序列设计特异性引物和 荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。条件允许的情况下，根据番茄斑萎病毒侵染寄主的症状 特点，进行生物学检测。 A.2寄主范围 物，可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害，如花生、莴苣、番木瓜、豌豆、烟草、甜椒、番茄、 秋海棠、菊花、大丽花等。 A.3病害症状 番茄斑萎病毒侵染不同的寄主及农作物后所产生的症状各不相同，常见症状为叶片上产生黄色或 褐色的环斑或线纹斑，有的叶片上形成坏死斑，在叶柄和茎秆上产生黑色条纹。发病植株通常矮化或顶 枯，有的萎為而最终死亡。 A.4分布 番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒，分布于欧洲和地中海地区、亚洲、 非洲、北美洲、中美洲和加勒比海、南美洲和大洋洲。 A.5传播方式 番茄斑萎病毒容易通过介体一一一蓟马以持久性方式进行自然传播，机械接种和嫁接也可传播，还可 以随寄主植物种子、苗木等进行国际间传播，特别是这些寄主带有传毒介体时更容易传播该病毒。 A.6粒体形态 病毒粒子球形，表面有一层膜包裹，膜外面由厚5nm、几乎连续的突起层组成，粒体直径80nm～120nm。