ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28099—2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola(Fang et al. ) Swings et al. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28099—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫 局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、南京农业大学。 本标准主要起草人：易建平、林石明、周国梁、栗寒、印丽萍、孔德英、许志刚、胡白石。 GB/T28099—2011 水稻细菌性条斑病菌的检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了水稻细菌性条斑病菌的检测和鉴定方法。 本标准适用于水稻种子及植株上水稻细菌性条斑病菌的检测与鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T0800.1进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3水稻细菌性条斑病菌基本信息 中文名：水稻细菌性条斑病菌（稻黄单胞菌稻生致病变种）。 学名：Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Fang et al.,1956)Swings et al.,1990,简称Xoc。 异名：Xanthomonascampestrispv.oryzicola（Fangetal.，1956）Dye1978；Xanthomonas oryzicola(Fang et al.,1956)Dowson 1943; Xanthomonas translucens f. sp.oryzicola(Fang et al., 1956)Bradbury 1971。 病害英文名：bacterial leaf streak of rice。 属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目 Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanthomonas(Dowson，1939）。 病菌主要在病种子和病草上越冬，其次在水稻再生苗或李氏禾等杂草上越冬。病菌主要借雨水、流 水等传播，带菌种子是远距离传播的主要途径之一。 水稻细菌性条斑病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据症状特征、菌落形态特征、生理生化特征、PCR反应和致病性测试结果等进行检测鉴定。 5主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 三羟甲基胺基甲烷盐酸盐（Tris-HCI）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基 三甲基溴化胺（CTAB）、三氯甲烷、异戊醇、乙醇、蛋白酶、溴化乙锭、酵母粉、琼脂、蛋白陈、牛肉浸膏、营 养肉汤、葡萄糖、蔗糖、谷氨酸钠。 培养基和试剂配方见附录B。 1 GB/T28099—2011 6仪器用具 超净工作台、高压灭菌锅、生物显微镜、培养箱、电子天平、冰箱、离心机、水浴锅、培养皿、三角瓶、剪 刀、电泳仪，PCR仪、凝胶成像系统、BIOLOG微生物鉴定系统、微量可调加样器和离心管。 7检测与鉴定 7.1现场检疫 按照SN/T2122和SN/T0800.1规定的程序进行现场检疫并抽取样品。 7.2实验室检测 7.2.1有症叶片的分离 有症叶片用无菌水冲洗后取病斑前沿2mm~7mm部分用70%酒精表面消毒15s，无菌水洗三次 后用无菌剪刀剪碎，置于无菌载玻片上，加一滴无菌水，不加盖玻片，置于显微镜下观察喷菌现象，如观 察到喷菌现象，从喷菌处用接种环取一环处理液在NA(PSA或NBY)培养基平板上划线分离，重复3个 平板，27℃培养3d~5d。 7.2.2无症叶片的分离 录C。阳性样品进行病菌分离。另取无症叶片10张，无菌水冲洗叶面，70%酒精表面消毒15s，无菌水 洗三次后用无菌剪刀剪碎，加入适量无菌水，静置15min，用接种环取处理液在NA（PSA或NBY）培养 基平板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d5d。 7.2.3从种子中分离 种子处理液在培养基上富集后进行PCR检测，100g种子磨碎后置于200mL含有0.01% Tween20的无菌水中4℃过夜，取100μuL处理液在PSA培养基平板上涂布，重复3个平板，27℃培养 1mL在无菌水中系列稀释三次，分别取稀释和未稀释的处理液100μL在NA(PSA或NBY)培养基平 板上划线分离，重复3个平板，27℃培养3d5d 7.3鉴定方法 7.3.1形态特征鉴定 NA培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整：初始为白色，后变为浅黄色；NBY 培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状；PSA培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌 落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定。 7.3.2生理生化鉴定 病菌能使明胶液化，使石蕊牛乳陈化，使阿拉伯糖产酸；不还原硝酸盐，产生氨和硫化氢；不产生吲 哚；可分解蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和乳糖等产生酸，但不产生气体；对青霉素、葡萄糖反应钝感。也可 用BIOLOG微生物自动鉴定系统进行鉴定 GB/T28099—2011 7.3.3PCR方法鉴定 制备分离物10°CFU/mL细菌悬浮液，1mL菌悬液提取DNA后进行PCR检测，检测程序见附 录C。 7.4致病性测试 三种鉴定方法之一为阳性的分离物进行致病性测试。30d～45d龄期大小的IR24或汕优63种植 在12h光照/黑暗的循环条件下，最适温度为28℃～32℃/22℃（白天/夜晚）。用无菌生理盐水配制 10°CFU/mL细菌悬浮液，无菌接种针蘸取菌液后针刺接种于叶片中部，每张叶片针刺两个点，共接种 30张～40张叶片。接种植株用塑料袋保湿24h，12h光照/黑暗的循环条件下30℃培养，接种48h～ 72h后观察症状，最长至14d。初始症状为接种点出现红色条斑，通常10d后显症，病斑边缘为线条 形，沿叶脉扩展。如果产生典型症状，从接种病斑上再次分离病菌，培养基上形态特征相符或PCR检测 为阳性即可认为接种分离物为水稻细菌性条斑病菌。 8结果判定 从样品中分离得到的可疑分离物用形态特征，生理生化或PCR检测等三种方法之一进行鉴定；阳 性分离物进行致病性测试，出现典型症状，判定为检测出Xoc；其余情况判定为未检出Xoc。 9样品保存 阳性种子样品至少保存6个月，至少1000粒，以备复核、谈判和仲裁：阳性的植物材料及时销毁处 理；分离菌株应妥善保存，将菌株转接到NA试管斜面上，28℃培养48h。然后置于4℃冰箱中保存，定 期（30d）转接；或在菌悬液中加入15%～30%甘油于一80℃下保存；必要时可将菌株冻干，一80℃下长 期保存。 3