ICS 65. 020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28095—2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phellinus noxius (Corner)G. Cunn. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T28095—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国江苏 出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张建成、陈先锋、丁国云、张慧丽、戴忠军、张培、王良华 GB/T28095—2011 木层孔褐根腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了木层孔褐根腐病菌Phellinusno.rius的检疫鉴定方法。 本标准适用于木材和苗木上的木层孔褐根腐病菌的检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T12728食用菌术语 SN/T1126进出境木材检疫规程 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 3术语和定义 GB/T12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 平伏反卷effused-reflexed 担子果在基物上的着生形态，其一部分贴附于基物上，边缘翘起反卷形成檐状、条状、半圆形或扇形 菌盖，有时呈覆瓦状叠生。整个担子果贴附于基物上，不形成菌盖的形态称为平伏（effused）。 3. 2 生殖菌丝 generativehyphae 担子果中基本的菌丝类型。在刺革菌科（Hymenochaetaceae）种类中，生殖菌丝只形成简单分隔， 不形成锁状联合，通常无色、浅黄色或浅黄褐色，薄壁或厚壁，分枝或很少分枝， 3.3 刚毛状菌丝 setalhyphae 在菌肉或菌髓中形态像菌丝，但明显比菌丝宽，且具有厚壁，顶端尖锐的结构。 4木层孔褐根腐病菌基本信息 中文名：木层孔褐根腐病菌。 学名：Phellinus norius(Corner)G.Cunn.1965。 异名:Fomes norius Corner 1932;Phellinidium norium (Corner)Bondartseva &. S.Herrera 1992。 病害英文名：brown root rotdisease。 属真菌界Fungi，担子菌门Basidiomycota，担子菌纲Basidiomycetes，刺革菌目Hymenochaetales 刺革菌科Hymenochaetaceae，木层孔菌属Phellinus。 木层孔褐根腐病菌的其他信息参见附录A。 1 GB/T280952011 5方法原理 根据木层孔褐根腐病菌在寄主植物上的症状，抽取可疑样品进行病原菌分离培养，根据病原菌的形 态特征、生物学特征和PCR特异性反应对病菌进行鉴定。 6仪器和用具 6.1仪器设备 体视显微镜、显微镜（具100×油镜和测微尺）、超净工作台、生物培养箱、冰箱、高压灭菌器、干热灭 菌器。 6.2实验用具 载玻片、盖玻片、滴管、培养血、镊子、解部刀、酒精灯、医用手术剪。 7试剂和材料 7.1试剂 7.1.1蒸馏水(H20)。 7.1.25%氢氧化钾（KOH)溶液（质量浓度）。 7.1.3棉蓝试剂：棉蓝（苯胺蓝）0.5g、乳酸60mL。 7.1.4Melzer试剂：碘（12)0.5g、碘化钾（KI)1.5g、水20g、水合氯醛22.5g。 7.2培养基 7.2.1大麦提取物琼脂（MEA）培养基 大麦提取物（MaltExtract）20g，琼脂（Agar)20g，加蒸馏水至1000mL。121℃高压湿热灭菌 30min，倒平板备用。 7.2.2选择性培养基 MEA培养基灭菌后，待冷却至40℃～50℃，加入100mg氨芋青霉素，10mg氯硝胺，10mg苯菌 灵，500mg没食子酸，混匀倒平板。 7.2.3马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基 自行配制或使用市售PDA培养基。 8现场检测 取样和抽样按照SN/T1157或SN/T1126方法进行 取样时应进行针对性检查，检查有无可疑症状，重点观察茎干基部1m范围内区域及根系是否包裹 子实体。直接挑出带有可疑症状的货物，将可疑部分切（锯）下，送实验室作进一步检验鉴定。 2 SZC GB/T28095—2011 9实验室检测 9.1分离和培养 将带病材料用自来水冲洗干净，洁净吸水纸吸干。去除树皮，用消毒的解剖刀片将内部病组织切成 约3mmX3mmX6mm小块，置于选择性培养基平板上，每个培养血放置5块，梅花状排列，30℃黑暗 培养5d~10d。选择性培养基上的褐色菌落转移到MEA培养基或PDA培养基30℃黑暗培养。长满 平板后，检查培养性状，在光学显微镜下观察菌丝形态特征。 9.2子实体观察 如发现病菌子实体，采用宏观形态观察和显微切片方法检测。 宏观形态观察使用体式显微镜，观察子实体的形态、色泽、菌盖、菌孔等特征。 显微切片检测方法，使用干标本制作成徒手切片，以蒸馏水、Melzer试剂和5%氢氧化钾溶液分别 做为浮载剂，在显微镜下观察菌丝及子实层中的担孢子、担子、菌髓等微观特征。显微测量和摄像均在 棉蓝试剂包理的切片中进行。抱子测量30个，其他结构如菌丝直径、担子大小等均测量10个，取极小 值与极大值，宽度测量于其结构的最宽部位，长度测量于其顶端至基部分隔处。 9.3PCR检测方法 SAC 培养物菌丝或病组织中病菌DNA提取和PCR检测方法见附录B。 引物PN-1F/PN-2R扩增病菌DNA，得到414bp或422bp扩增产物，则为PCR检测阳性，反之，为 阴性。所有真菌DNA均可与通用引物ITS-1和ITS-2结合扩增产生300bp左右的DNA片段。 10鉴定特征 10.1寄主上症状 树木根和茎基部表面多形成一层厚厚的黑褐色到黑色菌丝壳，坚硬，油浸状表面，根部菌丝壳常与 泥沙结合不明显。潮湿时，茎部菌丝壳的延伸边缘乳白色，约2cm宽，带有澄清褐色的渗出液滴。（参 见图C.1)树皮易剥落，病害引起软而脆的蜂窝状白色腐烂，受感染树皮内侧组织具不规则暗褐色菌丝 束形成的网纹（参见图C.2）。 10.2无性阶段特征 10.2.1培养性状 在含有没食子酸MEA培养基上，能产生扩散性的暗褐色色素。菌落不规则，菌落前缘菌丝气生至 平伏，初始白色至草黄色，渐渐转为黄褐色至褐色，有褐色网纹（参见图D.1）。 10.2.2显微特征 菌丝透明到褐色，不产生锁状联合，一般能够产生节孢子和毛状菌丝。节孢子（参见图D.2）由菌丝 断裂形成，与菌丝同色，球形到卵形。毛状菌丝（参见图D.3)鹿角状，菌丝分叉生长，表面有刺状突起。 10.3子实体形态 10.3.1整体特征 子实体单生，无柄，大小不一，平伏或平伏反卷形成窄的菌盖（参见图C.3和图C.4），长可达10cm， 3