ICS 11.220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22329—2008 牛皮蝇病诊断技术 Diagnostic techniques for bovine hypodermosis 2008-08-22发布 2008-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22329—2008 前言 本标准的附录A、附录B和附录C均为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：殷宏、罗建勋、关贵全。 GB/T22329—2008 牛皮蝇蛆病诊断技术 1范围 本标准规定了牛皮蝇病（bovinehypodermosis）诊断技术的要求，包括临床诊断、动物剖检和酶联 免疫吸附试验（ELISA）。 本标准适用于牛皮蝇病的诊断。 2临床诊断及剖检检查 2.1临床诊断 牛感染皮蝇后，一般不呈现明显的临床症状，但严重感染时，幼畜可表现出消瘦、生长缓慢、贫血，母 牛产乳量下降，役畜的使役能力降低等症状。当皮蝇幼虫钻人脑部时，可引起神经症状，如作后退运动、 突然倒地、麻痹或晕厥等，重者可造成死亡。此外，由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔，细菌感染而引起 化，形成瘘管，常有脓液和浆液流出，瘘管逐渐愈合，形成斑痕。但上述症状只能作为诊断的参考指 标，不能作为确诊的依据。只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎，且可挤出第三期幼虫 时，方能确诊。 2.2剖检检查 当对疫区开展流行病学调查时，经常采用此方法。重点检查部位为食道黏膜、背部皮下、瘤胃浆膜、 大网膜、食道浆膜等部位，如发现第一期、第二期或第三期任一阶段的幼虫，便可确诊。 2.2.1第一期幼虫的形态 呈乳白色，长3.5mm~12mm，宽0.75mm~2mm，前端稍尖 2.2.2第二期幼虫的形态 呈浅黄白色，长11mm～15mm，宽3mm～6mm。腹面微隆，背面平。外观口钩仅见两个黄褐色 的小圆点，彼此分离。 2.2.3第三期幼虫的形态 虫体长19mm~25mm，宽8mm~11mm，长宽比例（2.3~2.1）：1，背面平，腹面隆起，侧面有疣 状突，色泽因成熟程度不同而异，由淡黄白至淡褐色、黄褐色以至黑色，体具11节（胸部3节、腹部 8节），伪头部具一对头感器，彼此分离。口钩退化为黑色圆点。 3酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay；ELISA） 3.1试验材料 3.1.1抗原 制备方法见附录A。 3.1.2标准阳性血清 自牛皮蝇病流行区颈静脉采集背部有瘤包牛的血液，分离血清，经国外商品化试剂盒检测为阳性 后，按3：1（3体积血清：1体积甘油）加人甘油，混匀，分装于1.5mL离心管，一20℃保存备用 3.1.3标准阴性血清 自无牛皮蝇病流行的南方省份经颈静脉采集牛的血液，分离血清，经国外商品化试剂盒检测为阴 性后，按3：1（3体积血清：1体积甘油）加入甘油，混匀，分装于1.5mL离心管，一20℃保存备用。 3.1.4酶标记二抗 辣根过氧化物标记的免抗牛IgG，自生化试剂公司购买。 1 GB/T22329—2008 3.1.5血清样品的采集和处理 颈静脉采集动物血清，加叠氮化钠（0.01%）或硫柳汞（0.01%）进行防腐，4℃冷藏保存。 3.1.6溶液配制 自行配制，配置方法见附录B。 3.2操作方法 3.2.1抗原包被 用抗原包被液将抗原按使用说明稀释至工作浓度；用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔 内，每孔100μL，加盖后在37℃温箱内孵育1h，然后置4℃冰箱过夜；将包被液甩净，用洗涤液在洗板 机上按3×300μL程序，或用洗瓶重复洗涤5次。 3.2.2封闭 每孔加入封闭液200μL，37℃温箱内孵育30min，甩干，按3.2.1方法洗涤。 3.2.3血清稀释 用血清稀释液将待检血清和标准血清作1：200稀释。 3.2.4加样 按照附录C格式每孔加100μL待检血清，试验要同时设空白对照、酶标记二抗对照、标准阳性血 清对照和标准阴性血清对照。空白对照孔（A1，A2,B1,B2）和酶标记二抗对照孔（C1,C2,D1,D2）各加 100μL血清稀释液，加盖后37℃温箱内孵育1h。用3.2.1方法进行洗涤。 3.2.5加酶标记二抗 按说明书用洗涤液将酶标记二抗稀释至工作浓度，每孔加人100μL，但空白对照孔只加相应稀释 液，加盖后于37C温箱内孵育1h。用3.2.1方法进行洗涤、 3.2.6加底物 每孔加入现配制的底物溶液100μL，加盖后于37℃避光温箱内孵育40min。 3.3判定 3.3.1酶联免疫检测仪测定 用空白对照调零，在405nm波长处，测定每孔的光吸收值（OD值），分别计算出每份被检样品孔、 血清的平均OD值)大于2时，测定结果方为有效。否则，应查明原因，重做。 3.3.2结果判定 3.3.2.1当结果有效时，利用式(1)求出OD比值。 OD比值= 标准阳性血清平均OD值一标准阴性血清平均OD值 3. 3. 2. 2 OD比值小于或等于15%，判定为ELISA法阴性（一）；OD比值在16%～20%，判定为 ELISA法疑似（士）；OD比值大于或等于21%，判定为ELISA法阳性。疑似者复检一次，仍为疑似者 判为阳性。 2 GB/T22329—2008 附录A （规范性附录） 抗原的制备 A.2加人100mLpH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS），4℃搅拌过夜 3第二天加人15.54g硫酸铵，4℃轻摇30min。 A. 3 A.410000r/min，4℃离心20min，丢弃沉淀，收集上清液 A, 5 5在上清液中加入15.54g硫酸铵，4℃轻摇30min，10000rmin，4℃离心20min，弃上清，收集 沉淀。 SAG A.6将沉淀重溶于20mLpH7.2磷酸盐缓冲液中，装人透析袋，于4℃在清水中搅动透析1h，然后换 用pH7.2磷酸盐缓冲液，于4℃透析过夜。 A.7取出透析产物，10000r/min，4℃离心50min。 A.8收集上清，用紫外分光光度计测定蛋白含量，计算出抗原浓度，分装于1.5mL离心管，一20℃保 存备用。 3