ICS 07.100.30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19915.4—2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法 Method of detecting Streptococcus suis type 2 by triple-PCR 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19915.4—2005 前言 猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通 过伤口感染该菌，并导致死亡。为了区别正常猪所携带的猪链球菌2型无毒菌株与发病猪分离的致病 菌株，特制定本标准。本标准是采用现代分子生物学诊断技术制定的 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：南京农业大学 本标准主要起草人：陆承平、姚火春、范红结、何孔旺。 GB/T19915.4—2005 猪链球菌2型三重PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪链球菌2型荚膜基因（cps2）、溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和orf2这三个毒力基因 的三重PCR检测技术， 本标准适用于由猪链球菌2型致病基因和致病菌株的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 猪链球菌2型Streptococcussuistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌。 4测定方法 4.1方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落.加入PCR反应管中，进行PCR扩增.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物， 与标准分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。 4.2试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水。 4.2.1cps2、mrp和orf2的上下游引物，按合成说明书使用。 4.2.2 TaqDNA聚合酶。 4.2.3琼脂糖：电泳级。 4.2.4溴化乙锭。 4.2.5分子量标记：DL-2000。 4.2.6 TE 缓冲液:10 mmol/L Tris-HCI(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。 4.2.710XPCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,)zSO4,20mmol/LMgSO,200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1% TritonX-100,1 mg/mL BSA。 4.2.8电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加蒸馏水至 1000mL，使用时10倍稀释。 4.2.9加样缓冲液：0.25%漠酚蓝，40%糖。 4.2.10阳性对照猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板，阴性对照马链球菌兽疫亚种ATCC 35246株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板。 1 GB/T19915.4—2005 4.2.11猪链球菌2型三重PCR反应混合物。 4.3仪器和设备 4.3.1离心机。 4.3.2DNA热循环仪。 4.3.3核酸电泳仪。 4.3.4 pH计。 4.3.5移液器：10μL、20μL、100μL、1000μL。 4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。 4.3.7恒温水浴锅。 4.4PCR操作步骤 4.4.1阳性对照和阴性对照DNA模板的提取 分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC 25923株接种于5%特牛血清Todd-Hweitt肉汤培养基，37℃摇振培养18h，用革兰氏阳性细菌柱离心 式基因组DNA小量抽提试剂盒提取DNA模板，一20℃保存备用。 4.4.2PCR扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中，混 匀，加人Taq酶（2U/μL）0.7μL,2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增；同时设去离子水的空白 色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃C30s， 55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。 4.4.3琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后加人溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8L酶切 产物加入2μL5X上样缓冲液，混匀后加人上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测。 5结果及判断 5.1试验结果成立条件 阳性对照HA9801株经PCR扩增出现约858bp、387bp和316bp三条条带，去离子水的空白对 PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。 5.2结果判断 琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线投射下检测，在空白和阴、阳性对照成立的情况下，待检样品只出现 387bp一条条带，可判定为猪链球菌2型；待检样品出现约387bp、316bp和858bp三条条带，或出现 387bp和858bp两条条带，可判定为猪链球菌2型致病菌株；待检样品只出现858bp一条条带，可判 定为非猪链球菌2型的致病菌：待检样品不出现条带，结果为阴性。 6废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。 2 GB/T19915.4—2005 4.2.11猪链球菌2型三重PCR反应混合物。 4.3仪器和设备 4.3.1离心机。 4.3.2DNA热循环仪。 4.3.3核酸电泳仪。 4.3.4 pH计。 4.3.5移液器：10μL、20μL、100μL、1000μL。 4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。 4.3.7恒温水浴锅。 4.4PCR操作步骤 4.4.1阳性对照和阴性对照DNA模板的提取 分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡萄球菌ATCC 25923株接种于5%特牛血清Todd-Hweitt肉汤培养基，37℃摇振培养18h，用革兰氏阳性细菌柱离心 式基因组DNA小量抽提试剂盒提取DNA模板，一20℃保存备用。 4.4.2PCR扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重PCR反应混合物的PCR管中，混 匀，加人Taq酶（2U/μL）0.7μL,2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增；同时设去离子水的空白 色葡萄球菌ATCC25923株基因组DNA模板的阴性对照。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃C30s， 55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。 4.4.3琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后加人溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8L酶切 产物加入2μL5X上样缓冲液，混匀后加人上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测。 5结果及判断 5.1试验结果成立条件 阳性对照HA9801株经PCR扩增出现约858bp、387bp和316bp三条条带，去离子水的空白对 PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否则，结果不成立。 5.2结果判断 琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线投射下检测，在空白和阴、阳性对照成立的情况下，待检样品只出现 387bp一条条带，可判定为猪链球菌2型；待检样品出现约387bp、316bp和858bp三条条带，或出现 387bp和858bp两条条带，可判定为猪链球菌2型致病菌株；待检样品只出现858bp一条条带，可判 定为非猪链球菌2型的致病菌：待检样品不出现条带，结果为阴性。 6废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。 2