ICS 07. 100.30 C 53 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19915.3—2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术 Method for detection Streptococcus suis type 2 by PCR 2005-09-27发布 2005-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19915.3—2005 前言 猪链球菌病是链球菌属中猪源链球菌引致的猪链球菌病的总称，其病原主要有猪链球菌2型和马 链球菌兽疫亚种。猪链球菌2型可引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡。为 控制和预防该菌引致的猪链球菌病，建立快速、特异、敏感的检测方法是当务之急。本标准是采用公认 的细菌学诊断的现代分子生物学技术制定的。 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：南京农业大学。 本标准主要起草人：陆承平、范红结、姚火春、何孔旺。 GB/T19915.3—2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术 1范围 本标准规定了猪链球菌2型的PCR的定型方法。 本标准适用于由猪链球菌2型引致的病死猪分离菌的检测和定型。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 猪链球菌2型Streptococcus suistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是 一种重要的人畜共患病病原菌。 4测定方法 4.1方法提要 标准分子量标记比较，确定扩增产物的大小， 4.2试剂和材料 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水。 4.2.1猪链球菌2型定型PCR反应混合物和猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物。 4.2.2TaqDNA聚合酶。 4.2.3琼脂糖：电泳级。 4.2.4溴化乙锭。 4.2.5分子量标记：DL-2000。 )/ S 4.2.710XPCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO,,20mmol/LMgSO,200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1% TritonX-100,1 mg/mL BSA。 4.2.8电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）加蒸馏水至 1000mL,使用时10倍稀释。 4.2.9加样缓冲液：0.25%漠酚蓝，40%蔗糖 4. 2. 10 ）荚膜基因PCR引物和荚膜基因套式PCR引物。 4. 2. 11 阳性对照和阴性对照。 1 GB/T19915.3—2005 4.3仪器和设备 4.3.1离心机。 4.3.2DNA热循环仪。 4.3.3核酸电泳仪。 4.3. 4 pH计。 4.3.5移液器：10μL、20μL、100μL、1000μL。 4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。 4.4英膜基因PCR操作步骤 4.4.1PCR扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型PCR反应混合物的PCR管中，混 匀，加人Tag酶（5U/μL）0.5μL，2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增，同时设阳性对照和阴性 对照。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃20s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸7min，4℃ 保存。 4.4.2PCR产物回收 按SangongPCR产物回收试剂盒说明书进行。 4.4.2.1在25uLPCR产物中加入100μL结合缓冲液IⅡ（bindingbufferI），混匀。 4.4.2.2将混合物转移到2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，12000g室温离心 1 min。 4.4.2.3倒掉收集管中废液，将UNIQ-10柱放置同一个收集管中，加入250μL洗液（washsolution）， 12000g室温离心1min。 4.4.2.4倒掉收集管中废液，重复步骤4.4.2.3一次。 4.4.2.5取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000g室温 离心l min。 4.4.2.6将UNIQ-10柱放人一根新的1.5mL微量离心管中，在柱子膜中央加12μL洗脱缓冲液 (elutionbuffer）,37℃放置2min。 4.4.2.712000g室温离心1min，收集回收液 4.4.3酶切 0.5mLEpendoff管中依次加人： DNA(PCR回收产物）8.0μL Hind II 1.0 μL 10 X buffer 1. 0 μL 混匀，37℃酶切2h。 4.4.4琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后加入溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8μL酶切 产物加人2μL5×上样缓冲液，混匀后加人上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测。 4.4.5检测猪链球菌2型英膜基因的套式PCR 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物的PCR管 中，混匀，加入Tag酶（5U/μuL）1.0μL，2000r/min离心10s，立即进行PCR扩增。扩增条件为：95℃ 预变性3min；95℃40s.55℃30s，72℃40s30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。 5结果及判断 5.1试验结果成立条件 阳性对照经荚膜基因PCR扩增产物酶切后出现164bp和223bp两条条带后，阳性对照经套式 2 GB/T19915.3—2005 不成立。 5.2结果判断 在试验结果成立的前提下，如果样品中英膜基因PCR产物酶切后出现164bp和223bp两条条带， 或套式PCR出现178bp及387bp两条条带，表明猪链球菌2型英膜基因阳性，再结合液体培养出现短 链的特性，可确诊为猪链球菌2型 6废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。