ICS 65.080 B 10 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T19524.2—2004 肥料中虫卵死亡率的测定 Determination of mortality of ascarid egg in fertilizers 2004-05-31发布 2004-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 19524.2—2004 前言 本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出。 本标准由农业部微生物肥料质量监督检验测试中心负责起草 本标准主要起草人：姜昕、李俊、沈德龙、曹凤明、李力 GB/T19524.2—2004 肥料中蛔虫卵死亡率的测定 1 范围 本标准规定了肥料中虫卵死亡率的测定方法。 2测定方法原理 将碱性溶液与肥料样品充分混合，分离蛔虫卵，然后用密度较蛔虫卵密度大的溶液为漂浮液，使蛔 虫卵漂浮在溶液的表面，从而收集检验。 3仪器设备 往复式振荡器天平；离心机；金属丝圈（约$1.0cm）；高尔特曼氏漏斗；微孔火棉胶滤膜（35mm、 孔径0.65um~0.80μm）；抽滤瓶；真空泵；显微镜；恒温培养箱及其他试验室常用仪器、物品等。 4试剂 本标准所用试剂，在没有注明其他要求时，均指分析纯。 a）50.0g/L氢氧化钠溶液； b) 饱和硝酸钠溶液（密度1.38~1.40)； c） 500mL/L甘油溶液； d）20mL~30mL/L甲醛溶液或甲醛生理盐水。 5检验步骤 5.1样品处理 称取5.0g～10.0g样品（颗粒较大的样品应先进行研磨），放于容量为50mL离心管中，注入氢氧 化钠溶液25mL～30mL，另加玻璃珠约10粒，用橡皮塞塞紧管口，放置在振荡器上，静置30min后，以 200r/min～300r/min频率振荡10min~15min。振荡完毕，取下离心管上的橡皮塞，用玻璃棒将离心 管中的样品充分搅勾，再次用橡皮塞塞紧管口，静置15min～30min后，振荡10min～15min。 5.2离心沉淀 从振荡器上取下离心管，拔掉橡皮塞，用滴管吸取蒸馏水，将附着于橡皮塞上和管口内壁的样品冲 入管中，以2000r/min~2500r/min速度离心3min~5min后，弃去上清液。然后加适量蒸馏水，并 用玻璃棒将沉淀物搅起，按上述方法重复洗涤三次。 5.3离心漂浮 往离心管中加入少量饱和硝酸钠溶液，用玻璃棒将沉淀物搅成糊状后，再徐徐添加饱和硝酸钠溶 液，随加随搅，直加到离管口约1cm为止，用饱和硝酸钠溶液冲洗玻璃棒，洗液并入离心管中，以 2 000 r/min～2 500 r/min速度离心 3min～5 min。 硝酸钠溶液于离心管中，再次搅拌、离心及移置液膜，如此反复操作3次～4次，直到液膜涂片在低倍显 微镜下观察不到虫卵为止。 5.4抽滤镜检 将烧杯中混合悬液，通过覆以微孔火棉胶滤膜的高尔特曼氏漏斗抽滤。若混合悬液的浑浊度大，可 更换滤膜。 1 GB/T19524.2—2004 抽滤完毕，用弯头镊子将滤膜从漏斗的滤台上小心取下，置于载玻片上，滴加二、三滴甘油溶液，于 低倍显微镜下对整张滤膜进行观察和虫卵计数。当观察有虫卵时，将含有蛔虫卵的滤膜进行培养。 5.5培养 在培养血的底部平铺一层厚约1cm的脱脂棉，脱脂棉上铺一张直径与培养血相适的普通滤纸。为 防止霉菌和原生动物的繁殖，可加入甲醛溶液或甲醛生理盐水，以浸透滤纸和脱脂棉为宜。 将含虫卵的滤膜平铺在滤纸上，培养血加盖后置于恒温培养箱中，在28℃～30℃条件下培养，培 养过程中经常滴加蒸馏水或甲醛溶液，使滤膜保持潮湿状态。 5.6镜检 培养10d～15d，自培养皿中取出滤膜置于载玻片上，滴加甘油溶液，使其透明后，在低倍显微镜下 查找虫卵，然后在高倍镜下根据形态，鉴定卵的死活，并加以计数。镜检时若感觉视野的亮度和膜的 透明度不够，可在载玻片上滴一滴蒸馏水，用盖玻片从滤膜上刮下少许含卵滤渣，与水混合均匀，盖上盖 玻片进行镜检。 5.7判定 凡含有幼虫的，都认为是活卵，未孵化或单细胞的都判为死卵。 5.8结果计算 结果计算见式(1)： K=100(Ni-N2)/N, : ...(1) 式中： K—蛔虫卵死亡率，%； Ni——镜检总卵数； N一培养后镜检活卵数。 2 GB/T19524.2—2004 抽滤完毕，用弯头镊子将滤膜从漏斗的滤台上小心取下，置于载玻片上，滴加二、三滴甘油溶液，于 低倍显微镜下对整张滤膜进行观察和虫卵计数。当观察有虫卵时，将含有蛔虫卵的滤膜进行培养。 5.5培养 在培养血的底部平铺一层厚约1cm的脱脂棉，脱脂棉上铺一张直径与培养血相适的普通滤纸。为 防止霉菌和原生动物的繁殖，可加入甲醛溶液或甲醛生理盐水，以浸透滤纸和脱脂棉为宜。 将含虫卵的滤膜平铺在滤纸上，培养血加盖后置于恒温培养箱中，在28℃～30℃条件下培养，培 养过程中经常滴加蒸馏水或甲醛溶液，使滤膜保持潮湿状态。 5.6镜检 培养10d～15d，自培养皿中取出滤膜置于载玻片上，滴加甘油溶液，使其透明后，在低倍显微镜下 查找虫卵，然后在高倍镜下根据形态，鉴定卵的死活，并加以计数。镜检时若感觉视野的亮度和膜的 透明度不够，可在载玻片上滴一滴蒸馏水，用盖玻片从滤膜上刮下少许含卵滤渣，与水混合均匀，盖上盖 玻片进行镜检。 5.7判定 凡含有幼虫的，都认为是活卵，未孵化或单细胞的都判为死卵。 5.8结果计算 结果计算见式(1)： K=100(Ni-N2)/N, : ...(1) 式中： K—蛔虫卵死亡率，%； Ni——镜检总卵数； N一培养后镜检活卵数。 2