ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T18872—2017 代替GB/T18872—2002 饲料中维生素K3的测定 高效液相色谱法 Determination of vitamin K3 in feeds- High performance liquid chromatography 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 18872—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18872—2002《饲料中维生素K：的测定高效液相色谱法》。与GB/T18872- 2002相比，主要技术内容变化如下： 适用范围补充了精料补充料；增加饲料添加剂维生素K，的品种，即本方法还适用于以亚硫酸 氢烟酰胺甲萘醒和二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醒形式添加的维生素K。 范围中明确了维生素K的含量以甲萘醒计，测量范围2mg/kg以上修改为定量限 0.4 mg/kg。 改进样品的提取方法，由氨水水解改为碳酸钠溶液水解。 增加了亚硫酸氢钠甲茶醒、亚硫酸氢烟酰胺甲茶醒、二甲基嘧啶醇亚硫酸甲茶醒与甲茶醒之间 的转换系数。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所国家饲料质量监督检验中心 （北京）、广州爱保农饲料有限公司、中牧实业股份有限公司 本标准主要起草人：赵小阳、刘志英、朱高群、汪忠艳、郭红双。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T 18872—2002。 1 GB/T18872—2017 饲料中维生素K3的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了饲料中维生素K：（亚硫酸氢钠甲萘醒、亚硫酸氢烟酰胺甲萘醒、二甲基嘧啶醇亚硫酸 甲醌，以甲萘醒计）含量测定的高效液相色谱方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和精料补充料中维生素K：的测定。方法的 定量限为0.4mg/kg。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样经三氯甲烷和碳酸钠溶液提取并转化成游离甲醒，经反相C：柱分离，紫外检测器检测，外 标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，本标准所有试剂均为分析纯试剂，试验用水符合GB/T6682中三级用水规定，色谱 用水符合GB/T6682中一级用水规定，溶液按照GB/T603配制。 4.1三氯甲烷。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3 3无水碳酸钠。 4.4 碳酸钠溶液：c=1mol/L，称取无水碳酸钠（4.3)10.6g，加100mL水溶解，摇匀。 4.5无水硫酸钠。 4.6 硅藻土。 4.7 硅藻土和无水硫酸钠混合物：称取3g硅藻土与20g无水硫酸钠混匀。 4.8甲茶醒标准品：含量≥96%。 4.9 9甲萘醒标准贮备液：称取甲萘醒标准品（4.8）约50mg（精确至0.00001g）于100mlL棕色容量瓶 中，用甲醇溶解，稀释至刻度，混匀。该贮备液浓度约为500μg/mL，一18℃保存，有效期一年。 4.10甲萘标准工作液：准确吸取1.00mL甲萘醒标准贮备液（4.9）于100mL棕色容量瓶中，用甲醇 溶解，稀释至刻度，混匀。该工作液浓度约为5μg/mL，一18℃保存，有效期3个月。 1 GB/T18872—2017 5仪器和设备 5.1实验室常用仪器设备。 5.2天平，感量0.001g。 5.3天平，感量0.0001g。 5.4天平，感量0.00001g。 5.5旋转振荡器，200r/min。 5.6 离心机：不低于5000r/min（相对离心力为2988g）。 5.7 氮吹仪（或旋转蒸发仪）。 5.8 3高效液相色谱仪，带紫外可调波长检测器（或二极管矩阵检测器）。 6 采样和试样制备 按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样 按照GB/T20195制备试样，磨碎，全部通过0.25mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存 备用。 7分析步骤 警示一一因维生素K对空气和紫外光具敏感性，而且所用提取剂三氯甲烷溶液有一定毒性，所以 全部操作均应避光并在通风橱内进行。 7.1试样溶液的制备 称取维生素预混合饲料0.25g~0.5g（精确至0.0001g）或复合预混合饲料1g或浓缩饲料5g（精 确至0.001g）、配合饲料、精料补充料5g~10g（精确至0.001g），置入100mL具塞锥形瓶中，准确加 人50mL三氯甲烷（4.1）放在旋转振荡器（5.5）旋转振荡2min。加5mL碳酸钠溶液（4.4）旋转振荡 3min。再加5g硅藻土和无水硫酸钠混合物（4.7），于旋转振荡器上振荡30min，然后用中速滤纸过滤 （或移人离心管，5000r/min离心10min） 依据样品预期量、称样量和提取液量确定分取量（参见表A.1），准确吸取适量三氯甲烷提取液 （V2），用氮气吹干（或40℃旋转减压蒸干）。用甲醇（4.2）溶解，定容（V3），使试样溶液浓度为每毫升含 甲萘醒0.1ug~5μg。通过0.45um有机滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。 7.2测定 7.2.1参考色谱条件 色谱柱：Cls型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能类似的分析柱； 流动相：甲醇十水（75+25）； 流速：1.0mL/min； 柱温：室温； 进样量：5μL～20μL； 检测波长：251nm。 2 GB/T 18872—2017 7.2.2定量测定 依次注人相应的甲萘醒标准工作液（4.10）和试样溶液（7.1），得到色谱峰面积响应值，用外标法定 量测定，甲茶醒标准溶液色谱图参见图B.1。 8 结果计算 试样中甲萘醒的含量X，以甲萘醒在样品中的质量分数表示，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1） 计算： (1) P, XmXVz 式中： 试样溶液峰面积值； 提取液的总体积，单位为毫升（mL）； Vs- 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）： 甲萘醒标准工作液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； P2 甲茶醒标准工作液峰面积值； 试样质量，单位为克（g）； m V2 从提取液（V）中分取的溶液体积，单位为毫升（mL）。 注：饲料中维生素K：的添加剂有亚硫酸氢钠甲萘醒、亚硫酸氢烟酰胺甲萘醒和二甲基嘧啶醇亚硫酸甲萘醒，与甲 测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。 9 重复性 对于维生素K：含量小于100mg/kg的饲料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果与其算术 平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的20%； 对于维生素K：含量在100mg/kg～1000mg/kg范围内的饲料，在重复性条件下获得的两次独立 测定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%； 对于维生素K：含量大于1000mg/kg的饲料，在重复性条件下获得的两次独立测定结果与其算 术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%。 3