ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T18246—2019 代替GB/T18246—2000 饲料中氨基酸的测定 Determination of amino acids in feeds 2020-07-01实施 2019-12-10发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T18246—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18246—2000《饲料中氨基酸的测定》。 本标准与GB/T18246一2000相比，除了编辑性修改外，主要技术内容变化如下： 修改了标准的适用范围，增加了精料补充料，明确了不同处理方法所测定的氨基酸种类，增加 了各种氨基酸的摩尔质量和定量限（见第1章和附录A，2000年版的第1章）。 3章、第4章、第5章、第6章）。 修改了常规酸水解法盐酸水解溶液配方（见3.2.3，2000年版的4.1.1.1）。 增加了氧化酸水解测定含硫氨基酸以外其他氨基酸的方法（见4.2）。 修改了盐酸提取溶液配方（见6.2.3，2000年版的4.3.1）。 一增加了酸提取法中配合饲料、浓缩饲料和精料补充料样品的净化步骤（见6.5.1.2，2000年版的 7.1.3)。 修改了试验数据处理中的计算公式L见式（1）、式（3），2000年版的式（1）、式（2）」。 一修改了精密度的表述（见3.7、6.7，2000年版的第9章）。 修改了附录A的内容，修改为各种氨基酸的摩尔质量和定量限（见附录A，2000年版的附录 A)。 增加了氨基酸标准溶液色谱图（见附录B)。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 （北京）。 本标准主要起草人：贾铮、赵根龙、李兰、樊霞、肖志明、李阳、刘晓露。 本标准的历次版本发布情况为： GB/T18246—2000。 1 GB/T18246—2019 饲料中氨基酸的测定 1范围 本标准规定了饲料中总氨基酸（肽键结合和游离的）和游离氨基酸（天然和添加的）测定方法，包括 常规酸水解法、氧化酸水解法、碱水解法和酸提取法。 常规酸水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中含硫氨基 酸（胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸）和色氨酸以外的其他氨基酸（天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨 酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸)含量的测定。 氧化酸水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸 和蛋氨酸）的测定。以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，可测定除酪氨酸、色氨酸以外的其他蛋白水解氨 基酸；以氢漠酸为终止剂时，可测定除酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸 碱水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定。 酸提取法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中游离氨基酸的测定。 各氨基酸的定量限见附录A中表A.1。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T15399饲料中含硫氨基酸的测定离子交换色谱法 GB/T15400 饲料中色氨酸的测定 GB/T20195动物饲料试样的制备 JG1064氨基酸分析仪 3常规酸水解法 3.1原理 饲料中蛋白质在110℃、6mol/L盐酸溶液作用下水解成氨基酸，经离子交换色谱分离和三酮柱 后衍生化，脯氨酸于440nm波长处测定，其他氨基酸于570nm波长处测定。 3.2试剂或材料 除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯。 3.2.1水：应符合GB/T6682中一级水的规定。 1 GB/T18246—2019 3.2.2盐酸：优级纯。 3.2.3盐酸水解溶液（6mol/L）：将500mL盐酸（3.2.2）与500mL水混合，加1g苯酚，混匀。 3.2.4柠檬酸钠缓冲溶液LpH=2.2.c（Na+）=0.2mol/L]：称取柠檬酸三钠19.6g于1000mL容量 瓶中，加水溶解后加入盐酸（3.2.2）16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，用水定容并过滤。 3.2.5氨基酸标准储备溶液：含17种常规蛋白水解液分析用氨基酸（天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷 氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、颗氨酸、组 氨酸和精氨酸），各组分浓度均为2.50μmol/mL，应使用有证标准溶液。 3.2.6氨基酸标准工作溶液：准确移取2mL的氨基酸标准储备溶液（3.2.5）置于50mL容量瓶中，以 柠檬酸钠缓冲溶液（3.2.4）定容，各氨基酸组分浓度为100nmol/mL，用安龍分装密封，每支约1mL，在 2℃～8℃下保存，有效期3个月。 3.2.7不同pH值和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与节三酮溶液：按照仪器说明书配制或购买。 3.2.8液氮。 3.3 仪器设备 3.3.1 氨基酸自动分析仪：具备阳离子交换柱、节三酮柱后衍生装置及570nm和440nm光度检测器。 3.3.2天平：感量0.1mg和0.01mg。 3.3.3真空泵。 3.3.4喷灯。 3.3.5恒温干燥箱：温度可达110℃±2℃。 3.3.6离心机：转速不低于4000r/min。 3.3.7旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控温精度土1℃，真空度可低至3.3×103Pa (25 mmHg)。 3.4样品 按GB/T20195进行样品制备，粉碎过0.25mm孔径筛，混合均匀，装入密闭容器中保存，备用。 对于粗脂肪含量大于或等于5%的样品，需将脱脂后的样品风干，混匀，装入密闭容器中备用。对 于粗脂肪小于5%的样品，可直接称样。 3.5试验步骤 3.5.1样品前处理 平行做两份试验。称取试样50mg~100mg（含蛋白质约7.5mg~25mg，精确至0.1mg）于 20mL安或水解管中，准确加人10mL盐酸水解溶液（3.2.3），置液氮（3.2.8）中冷冻，使用真空泵抽真 空至7Pa（≤5×10-2mmHg）后用喷灯封口或充氮气1min后旋紧管盖。将安或水解管放在110℃ 转蒸发器或浓缩器中，60℃下抽真空蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1次～2次。加人3mL～ 5ml柠檬酸钠缓冲溶液（3.2.4）复溶，使试样溶液中氨基酸浓度达到50nmol/mL~250nmol/mL，摇匀，过 滤或离心，上清液待上机测定 2 GB/T18246-—2019 3.5.2测定 将氨基酸标准工作溶液（3.2.6）注人氨基酸自动分析仪，以不同pH和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶 液与节三酮溶液（3.2.7）作为流动相和衍生剂，适当调整仪器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配 比，应符合JJG1064氨基酸分析仪检定规程的要求，并保证苏氨酸-丝氨酸、甘氨酸-丙氨酸以及亮氨酸 异亮氨酸分离度分别不得小于85%、90%和80%，其标准溶液色谱图参见附录B的图B.1、图B.2。注 人制备好的试样溶液和相应的氨基酸标准工作溶液进行测定，每5个样品（即10个单样）为一组，组间 插入氨基酸标准工作溶液（3.2.6）进行校准。以保留时间定性，单点外标法定量。试样中氨基酸的峰面 积应在标准工作溶液相应峰面积的30%200%，否则应用柠檬酸钠缓冲溶液（3.2.4)稀释后重测。 3.6试验数据处理 试样中氨基酸含量以其质量分数（%）计，未脱脂试样按式（1）计算，脱脂试样按式（2）计算： X100 .(1) AXmXVX105 nXA,XVXcXMXVst ×100 ×(1-F) = m ...(2) AstXm XV,X10 式中： 试样水解溶液稀释倍数； n 试样溶液中对应氨基酸的峰面积； V 试样水解溶液体积，单位为毫升（mL）； c 标准工作溶液中对应氨基酸的浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）； M 氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol），各氨基酸摩尔质量见表A.1； Vat 氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升（μuL）； Ast 氨基酸标准溶液中对应氨基酸的峰面积； m 试样质量，单位为毫克（mg）； 试样溶液进样体积，单位为微升（μL）； F 粗脂肪含量，%。 以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数。 3.7精密度 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，当含量不大于0.5%时，不 超过这两个测定值算术平均值的5%；含量大于0.5%时，不超过4%。 4氧化酸水解法 4.1含硫氨基酸的测定 按GB/T15399的规定执行。 4.2 2其他氨基酸的测定 4.2.1原理 以偏重亚硫酸钠为氧化正剂时，可测定除酪氨酸、色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸；以氢漠酸 3