ICS 11.220 B 41 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 18089—2008 代替GB/T18089—2000 蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和 抗体检测技术 Isolation,identification and serum neutralization antibody test in Bluetonguevirus 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T18089—2008 前言 本标准代替GB/T18089一2000《蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法》。 本标准与GB/T18089一2000相比主要变化如下： 对标准名称进行了修改； 删除了蓝舌病病毒鉴定中的病毒中和试验部分； 一增加了病毒鉴定中RT-PCR方法的鉴定。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：周晓黎、杨建明、艾军、花群义、杨晓花、张其艳、严树发、董俊、叶玲玲、徐维加。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18089—2000。 I GB/T18089—2008 蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和 抗体检测技术 1范围 本标准规定了蓝舌病病毒分离、鉴定及血清中和抗体检测的技术。 本标准适用于蓝舌病病毒的分离、鉴定及动物感染蓝舌病病毒后血清中和抗体的检测。 2符号和缩略语 下列符号和缩略语适用于本标准。 BHK21 -幼仓鼠肾细胞株； BLP 乳糖蛋白陈缓冲肉汤； BT—蓝舌病; bp 碱基对； CPE- 致细胞病变作用； C6/36- 蚊子细胞株； DEPC- 焦碳酸二乙酯； SPF 无特定病原体； TCIDs0 半数组织培养感染量； Vero 非洲绿猴肾细胞株。 3蓝舌病病毒分离 3.1材料 10日龄～11日龄SPF鸡胚。 3.2设备与器材 鸡胚开孔器、照蛋灯或照蛋箱、乳钵或组织捣碎器、倒置显微镜 3.3试验程序 3.3.1样品 肝素抗凝血（每5mL血液用10IU肝素）、脏器（脾、肝、肾、淋巴结）、精液、库螺。用于病毒分离的 样品应置冷藏容器中保存，在24h内送到实验室，并立即进行处理。 3.3.2血液样品制备 取肝素抗凝血5mL，用磷酸盐缓冲液（PBS，配方见附录A）洗涤血样3次～4次，每次2000r/min 离心10min，弃上清液后加入倍量BLP（配方见附录A)，置冰浴中用超声波处理（40μA、1min）。经处 理的样品当天使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保存备用。 3.3.3组织样品制备 无菌采集动物脾、淋巴结、肝、肾各5g，剪碎后加人BLP10mL（含青霉素2000IU/mL、链霉素 2000μg/mL），置乳钵中研磨，4℃冰箱中浸提4h，取上清液5mL用超声波裂解处理（100μA、1min～ 2min）或冻融三次，3000r/min离心20min，取上清液使用，使用前置4℃保存，剩余样品置一70℃保 存备用。 3.3.4精液样品制备 取精液样品0.5mL，用BLP作1：5稀释后，3000r/min离心20min，弃上清液，再用BLP作 1