ICS 11. 220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 17999.5—2008 代替GB/T17999.4—1999 SPF 鸡 微生物学监测 第5部分：SPF鸡 琼脂扩散试验 SPF chicken—Microbiological surveillance- Part 5: Agar gel precipitation test for SPF chicken 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 17999.5—2008 前言 GB/T17999《SPF鸡 微生物学监测》分为10个部分： 第1部分：SPF鸡 微生物学监测总则； 第2部分：SPF鸡 红细胞凝集抑制试验； 第3部分：SPF鸡 血清中和试验； 第4部分：SPF鸡 血清平板凝集试验； 第5部分：SPF鸡 琼脂扩散试验； 第6部分：SPF鸡 酶联免疫吸附试验； 一第7部分：SPF鸡 胚敏感试验； 第8部分：SPF鸡 鸡白痢沙门氏菌检验； 第9部分：SPF鸡 试管凝集试验； 第10部分：SPF鸡 间接免疫荧光试验。 本部分为GB/T17999的第5部分。 关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法》NY/T556一2002《鸡传染性喉气管炎诊断技术》、OIE《陆生动物 （哺乳动物、禽鸟和蜜蜂）诊断试验和疫苗手册》（第五版）中的有关规定。 本部分代替GB/T17999.4一1999《SPF鸡琼脂扩散试验》。 SAG 本部分与GB/T17999.4—1999相比主要变化如下： 增加了加样示意图、结果判定示意图以示说明； 增加了附录A“马立克氏病病毒抗原琼脂扩散检验的程序”； 增加了附录B试剂的配制”。 本部分的附录A、附录B为规范性附录。 本部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法 斯家禽有限公司。 本部分主要起草人：曲连东、姜骞、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、刘家森、司昌德、郭东春、于海波、 孟庆文。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T17999.4—1999。 GB/T17999.5—2008 SPF鸡微生物学监测 第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验 1范围 GB/T17999的本部分规定了琼脂扩散试验的技术要求。 本部分适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测：禽流感病毒（AvianInflueza Virus）、传染性支气管炎病毒（InfectiousBronchitisVirus）、传染性法氏囊病病毒（InfectiousBursa DiseaseVirus），传染性喉气管炎病毒（InfectiousLaryngotracheitisVirus）、禽痘病毒（FowlPox Virus）、禽脑脊髓炎病毒（AvianEncephalomyelitisVirus）、网状内皮增生症病毒（Retieuloendotheliosis Virus）、禽呼肠孤病毒（病毒性关节炎）（AvianReovirus）、马立克氏病病毒（Marek'sDiseaseVirus）、禽 腺病毒I群（AvianAdenovirusGroupI）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）。本部分同样适用 于对SPF鸡进行马立克氏病病毒（Marek'sDiseaseVirus）抗原的检测（见附录A）。 2原理 抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向四周自由扩散，二者互相结合，在最适比例处出现沉 淀线。采用已知抗原检测相应的抗体，或已知抗体鉴定相应的抗原。 3试剂和材料 3.1试剂 3.1.1琼扩抗原或抗体。 3.1.2标准阳性血清。 3.1.3被检血清或羽髓。 3.1.40.01mol/L、pH7.2的8%氯化钠磷酸盐缓冲溶液（见附录B)。 3.1.50.01mol/L、pH6.4的8%氯化钠磷酸盐缓冲溶液（检测禽流感病毒抗体时使用，见附录B)。 3.1.6优质琼脂粉或琼脂糖。 3.2材料 琼扩板，打孔器，移液器。 4操作程序 4.1琼脂板制备 将1g优质琼脂粉或0.8g~1.0g琼脂糖加人100mL的0.01mol/L、pH7.2的8%氯化钠磷酸缓 冲液中（检测禽流感病毒抗体时使用），水浴加热融化，稍凉（60℃～65℃），倒人琼扩板内（厚度为 3mm），待琼脂凝固后，4℃冰箱保存备用 4.2打孔 用打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径3mm～4mm，孔距3mm。用8号针头挑出孔内 琼脂，挑出时从孔一侧边缘插人针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上挑出。 4.3封底 用酒精灯轻烤平皿底部至微融化，以防侧漏 4.4加样 用移液器吸取抗原悬液，滴入中间孔（图1中的①号孔），周围①、①号孔加阳性血清，其余孔加被检 1