ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36818—2018 冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Gremmeniella abietina (Lagerberg)Morelet 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36818—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民 共和国山东出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：王颖、程颖慧、汪莹、章桂明、高瑞芳、李芳荣、史亚千、郑耘、封立平。 GB/T 36818—2018 冷杉枯梢病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了冷杉枯梢病菌[Gremmeniellaabietina（Lagerb.）M.Morelet]的检疫鉴定方法。 本标准适用于冷杉枯梢病菌寄主及其产品携带冷杉枯梢病菌的检疫鉴定。 2基本信息 中文名：冷杉枯梢病菌 英文名：Scleroderriscanker 学名:Gremmeniella abietina(Lagerb.)M.Morelet 名:Ascocalyr abietina (Lagerb.) Schlapf.-Bernh.,Crumenula abietina Lagerb., C.Pinea (P. Karst.)Ferd.&. C.A.Jorg.,Godronia abietina(Ellis &. Everh.) Seaver,Gremmeniella abietina var.abi- etina (Lagerb.) M.Morelet,G.abietina var.balsamea Petrini, L.E.Petrini,Lafl.& Ouell.,Lagerbergia abietina (Lagerb.)J.Reid ex Dennis,Pragmopora abietina (Ellis &. Everh.) J.W.Groves,Scleroderris abietina(Lagerb.)Gremmen,S.lagerbergii Gremmen. 无性态：Brunchorstiapinea（P.Karst.)Hohn. 无性态异名:Brunchorstia destruens Erikss.,B.pinea(P.Karst.)Hohn.,B.pineavar.cembrae M. Morelet,B.pini Allesch.,B.pinea var.pinea (P.Karst.) Hohn,Ercipulina pinea (P.Karst.) Hohn., Septoria pinea P.Karst. 分类地位：真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、柔膜菌目（Helotia- les）、柔膜菌科（Helotiaceae）、Gremmeniella属。 近似种:Sphaeropsis sapinea，Crumenulopsis sororia，Gremmeniella laricina，Cenangium ferrug inosum 冷杉枯梢病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 冷杉枯梢病菌的病害症状与形态学特征是鉴定该病菌的主要依据。 4仪器及用具 4.1仪器 烘箱、高压灭菌锅、显微镜、解镜、光照培养箱、天平（感量1/100g）、冰箱、超净工作台等。 4.2用具 样品袋、标签、放大镜、培养皿、载玻片、盖玻片、三角瓶、试管、烧杯、手术刀、手术剪、镊子、研钵、量 筒、吸管、酒精灯、滤纸等。 1 SAG GB/T36818—2018 5试剂 5.1试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂 1%次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%乙醇、无菌蒸馏水 V8汁、麦芽提取物、马铃薯、琼脂、小麦。 5.2培养基 V8汁麦芽提取物培养基、小麦培养基、PDA培养基，配方参见附录B。 6病原菌鉴定 6.1症状检查 在芽、针叶、枝条或茎上出现橘色至褐色病斑，受侵严重时会出现细弱、扭曲的嫩枝或丛枝，甚至造 成枝条枯死，树干上则会形成溃疡斑。在病斑上的黑色小点为病菌的分生孢子器，在茎或针叶上单生或 聚生，深褐色至黑色，子座状，有时连成一片，约1mm大小。子囊盘一般出现在树皮、死亡枝条或针叶 基部，聚生，表面开口，有短柄，在潮湿条件下呈奶油色或浅灰色 将可疑样品带回实验室做进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期 等信息。 6.2直接镜检 将有成熟子实体的病枝或针叶置于体视显微镜下检查，挑取病部子实体制成玻片，置于显微镜下进 行镜检及病原菌的分离培养。 6.3 保湿培养 下每天16h光照/8h黑暗交替培养，待发现子实体时，进行显微镜检及病原菌的分离培养。 6.4分离培养 6.4.1针叶上病原菌的分离培养 将针叶从树梢上取下，用自来水冲洗30min，1%的次氯酸钠表面消毒10min，无菌水冲洗3次，在 后转到V8汁麦芽提取物培养基上17℃每天16h/8h黑暗交替培养。 6.4.2树梢、树枝及茎干上病原菌的分离培养 取树梢、树枝及茎干的发病部位，用自来水冲洗30min，1%的次氯酸钠表面消毒10min，无菌水冲 洗3次，在灭菌滤纸上晾干，剥去树梢、树枝及茎干的外皮，剪成3mm长小片，置于水琼脂培养基5℃～ 10℃黑暗培养3周左右，待长出菌丝后转到V8汁麦芽提取物培养基上17℃每天16h/8h黑暗交替 培养。 如果不产抱：也可将病菌接种到小麦培养基上刺激产抱 2 GB/T36818—2018 6.4.3病菌形态特征和培养性状观察 观察记录病菌的培养性状、形态特征包括菌落的生长速度、颜色变化、孢子的形成情况、产孢方 式等。 7鉴定特征 7.1病菌培养性状 冷杉枯梢病菌在V8汁麦芽提取物培养基上生长缓慢，菌落白色、绿色或灰绿色，有时产生黄色的 气生菌丝，参见附录C。病菌生长的最低温度为一5℃，最高温度为30℃，最适生长温度在13℃~ 20 ℃之间。 7.2病菌形态 分生孢子器深褐色至黑色，子座状，多腔，无孔口；分生孢子器壁厚度为几个细胞大小，由外部硬化 （芽生抱子）无色透明、梭形，分生抱子两端稍弯，具3个～7个隔膜，多数三隔，分隔处不缩，天小 (25 μm~40 μm)X(3 μm~3.5 μm) 子囊盘聚生，表面开口，有短柄。子囊层奶油色，子座深褐色至黑色，边缘不明显。囊盘被由几层深 色的多边形细胞组成，向边缘硬化，不规则的细胞向外突出。子囊稍棒形，具短柄，无囊盖，内含8个子 囊孢子，（100μm~120um）×（6.5μm~10.5μm），子囊双囊壁。子囊孢子双列，无色，椭圆形，有时稍 分隔。参见附录D。 7.3与近似种及引起相似症状的病菌的区别 G.abietina的近似种主要是松树枯梢病菌Sphaeropsissapinea、Cr.sororia、G.laricina、红松烂皮 病菌Ce.ferruginosum。冷杉枯梢病菌与其近似种的形态学的主要区别为： 一S.sapinea分生孢子很大，（30μm～45μm）×（10μm~16μm），深褐色。 一Cr.sororia分生孢子指状，子囊座黑色，边缘明显，具黑色刚毛。 —G.laricina分生孢子较短，15μm～23μm）×（3μm～4μm），1隔~3隔；子囊孢子1隔 一Ce.ferruginosum子囊孢子无分隔，椭圆形。 8结果判定 病害症状符合6.1、病菌形态学特征符合第7章则可判定为冷杉枯梢病菌（Gremmeniellaabietina）。 9样品保存与处理 保存样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现冷杉枯梢病菌，该样品应 保存1年，以备复验。保存期满后，需经灭菌处理。 10菌种保存与处理 3