ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36812—2018 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法 Molecular detection method of Potato yellow dwarf virus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36812—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 局、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：沈建国、蔡伟、高芳銮、张永江、陈细红、李敏、王宇、吴祖建、陈寿铃 GB/T36812—2018 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法 1范围 本标准规定了马铃薯黄矮病毒（Potatoyellodarfuirus）的分子生物学检测方法 本标准适用于可能携带马铃薯黄矮病毒的植物及植物产品检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964植物病毒检测规范 SN/T3457 7：植物病毒分子生物学检测规范 3 马铃薯黄矮病毒基本信息 中文名：马铃薯黄矮病毒 学名：Potatoyellowdwarfvirus，缩写PYDV。 分类地位：弹状病毒科（Rhabdoviridae）、细胞核弹状病毒属（Nucleorhabdovirus）。 马铃薯黄矮病毒的其他信息参见附录A。 4 方法原理 马铃薯黄矮病毒的分子生物学特性是制定本检测方法的主要依据。 5仪器、用具及试剂 C 5.1仪器 SAC 温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。 5.2用具 可调移液器（2.5μL，10μL，20L，100μL，200μL，1000μL）和可调移液器枪头离心管、研 钵等。 5.3试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。RT-PCR检测试 剂见附录B；实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C。 1 GB/T368122018 6抽样和样品制备 6.1抽样 尽量抽取有病毒危害症状的植物材料，PYDV的危害症状描述参见附录A；抽样方法按照 SN/T2122中规定执行。 6.2样品制备 分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行。 7检测鉴定 7.1RT-PCR 检测 以含PYDV材料作为阳性对照，以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替 模板作为空白对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见 附录B。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 7.2 实时荧光RT-PCR检测 以含PYDV材料作为阳性对照，以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替 体操作见附录C。如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。 8结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： RT-PCR初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带PYDV；若检测结果为阳性，则采用 PCR产物序列测定或实时荧光RT-PCR进行验证： 若验证结果为阳性，则判定样品携带PYDV；若验证结果为阴性，则判定样品不携带PYDV。 一 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带PYDV的样品应保存在适合的条件下以备复核。种苗、叶片等样品保存在 一80℃冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年。 9.2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。RT-PCR检测应有电泳图 片；实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片。 2 GB/T 36812—2018 附录A （资料性附录） 马铃薯黄矮病毒相关资料 A.1寄主范围 已报道的寄主包括茄科、夹竹桃科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、蓼科和玄参科植物，主要自然寄 主为马铃薯（Solanumtuberosum）。 A.2 病害症状 侵染马铃薯引起病株矮缩、黄化，茎的生长点早期坏死等症状（见图A.1）54c 注：引自CornellUniversity，Bugwood.org。 图A.1PYDV侵染马铃薯引起的症状 A.3分布地区 主要分布于加拿大、美国。 A.4传播途径 主要经昆虫介体叶蝉Aceratagalliasanguinolenta、Aceratagallia sp.、Agalliaconstricta传播，也 可通过带毒种薯、块茎远距离传播。 A.5粒体形态 病毒粒体有包膜，杆菌状或子弹状，大小约380nm×75nm。 3