ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35942—2018 隐孢子虫套式PCR检测方法 Nested PCR method for detection of Cryptosporidium spp. 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35942—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准主要起草人：陈兆国、米荣升、黄燕、刘陆世、王岩 GB/T 35942—2018 隐孢子虫套式PCR检测方法 1范围 本标准规定了隐孢子虫套式PCR检测方法 本标准适用于动物的隐孢子虫感染的检测、流行病学调查和出入境检验检疫 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 WS/T2302002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）。 PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）。 TAE:Tris-乙酸电泳缓冲液（TrisAcetate-EDTABuffer)。 EB：溴化乙锭（EthidiumBromide)。 BSA：牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin)。 4 仪器、材料与试剂 4.1 仪器 4.1.1 PCR基因扩增仪。 4.1.2 高速台式冷冻离心机。 4.1.3 低速大容量离心机。 4.1.4 微量可调移液器：2μL、10μL、20μL、200μL、1000μL。 4.1.5 核酸电泳仪。 4.1.6 核酸电泳槽。 4.1.7 凝胶成像分析系统。 4.1.8 生物样品均质研磨仪。 4.1.9 高压蒸汽灭菌器。 4.2材料 4.2.1 一次性封口袋。 4.2.2 棉拭子。 4.2.3 一次性PE手套。 1 GB/T35942—2018 4.2.4压舌板或玻棒。 4.2.5烧杯：100mL。 4.2.6 纱布。 4.2.7 漏斗。 4.2.8铁架台。 4.2.9 离心管：1.5mL、2.0mL、15.0mL.50.0mL。 4.2.10 200μLPCR管。 4.3 3试剂 4.3.1 磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录A）。 4.3.2 5%重铬酸钾溶液（见附录A）。 4.3.3 1XTAE（见附录A）。 4.3.410mg/mL溴化乙锭（EB)或同类核酸染料。 4.3.5 ：土壤基因组DNA提取试剂盒：市售产品。 4.3.6水：实验中配制溶液的用水应为蒸馏水或去离子水；PCR用水符合GB/T6682中一级水的 规格。 4.3.7 DNA聚合酶：市售产品 4.3.8 2XPCRBuffer：市售产品 4.3.9 2.5mmol/LdNTPs（含MgCl2）：市售产品。 4.3.10 20mg/mL牛血清白蛋白（BSA）。 4.3.11 引物（上，下游外引物和内引物浓度分别配成100μm/mL，引物序列见附录B） 4.3.12 2100bpDNA分子质量标准。 4.3.13琼脂糖（电泳级）。 4.3.14质控标准卵囊：微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum）lowa株、贝氏隐孢子虫（C.baileyi）、 105个卵囊。阴性质控对照为不含隐孢子虫卵囊的去离子水或其他适宜的溶液。 废弃物处理和防止污染的措施 废弃物处理和检验过程中防止交叉污染的措施，按照WS/T230一2002中第6章?污染的预防和控 制”的规定执行（见附录C)。 6样品的采集、保存和运输 6.1样品的采集 用棉拭子从禽类泄殖腔或直接从哺乳动物直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约20g，装 入一次性封口袋。采样过程中应戴一次性手套，采样过程中样本间避免交叉污染。每份样品标记样品 编号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址。 6.2样品的保存和运输 采集的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过72h，长期保存需加入等体积5%重铬酸钾溶液，装 人灭菌容器内4℃保存。检出的阳性样品，发出报告后30d方可无害化处理。 样品运送应放在一个不透水、防泄漏的容器内，保证完全密封。将上述容器置于结实、不透水和防 2 GB/T35942—2018 泄漏的辅助包装中。冷冻剂放在辅助包装周围，使样品保持低温，确保样品在48h内送达实验室。所 有样品应附有一份说明，包括样品提交人、样品来源地、动物种类和年龄、与动物有关的病史、测试要求 以及联系方式等。 7样品的预处理 7.1穿上防护服，戴上一次性手套。将经高压灭菌或80℃～100℃烘烤20min的60目～100目铜筛 网置于无菌漏斗中，放置在固定好的铁架台上，漏斗下端置于50mL离心管中。取10g待检样品（若是 成形的粪便应混匀；若粪便是液体，混匀后取10mL）放人烧杯中，加30mLPBS，玻棒或压舌板混匀后 经60目～100目铜筛网过滤至离心管中。 7.2滤液用移液器吸取1.5mL放人2mL离心管中，一20℃保存，用于DNA提取， 保存备用。 8操作程序 8.1DNA抽提 将保存于2mL离心管中的样品以1500g离心5min后，弃上清，沉淀用于DNA的提取，按从粪 便、土壤中提取DNA的商品化试剂盒推荐的操作方法进行。 8.2套式PCR检测 8.2.1第一轮PCR扩增 按下列方法配制50μLPCR扩增反应体系： 2XPCRBuffer(含MgCl,) 25 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 6 μL BSA(20 mg/mL) 1.5 μL P1-1(100 μmol/L) 1 μL P1-2(100 μmol/L) 1 μL DNA 聚合酶(1.0 U/μL) 1 μL DNA模板 2 μL PCR用水 12.5 μL 第一轮PCR扩增参数：94℃预变性3min；94℃变性45s，55℃退火45s,72℃延伸1min，35个 循环；72℃延伸7min。外引物为P1-1和P1-2（见B.1)。阳性对照模板为105个4.3.14中所列的隐孢 子虫卵囊或适宜的质控隐孢子虫卵囊加人10g不含隐孢子虫卵囊的同种动物新鲜粪便，按照8.1所列 方法提取的、浓度在102拷贝/uL～105拷贝/μuL的隐孢子虫基因组DNA样品；阴性对照模板为10g 不含隐孢子虫卵囊的同种动物新鲜粪便按8.1所列方法提取的DNA。 8.2.2第二轮PCR扩增 按下列方法配置50μLPCR扩增反应体系： 2× PCR Buffer(含 MgCl2) 25 μL dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 6 μL BSA(20 mg/mL) 1.5 μL 3