ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35912—2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR method for detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 35912—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出人境检验检疫局、湖南圣湘生物科技有限公司、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、李树清、花群义、杨忠苹、李国新、王巧全， 王艳、林颖、蔡开妹、喻正军、林祥梅、吴绍强。 GB/T 35912—2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒美洲型毒株核酸检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Real-timeRT-PCR：荧光反转录聚合酶链式反应（real-time reverse transcriptpolymerase chainre- action) Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) Taq酶:Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffer） DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsolution） 4仪器 4.1 荧光PCR检测仪。 4.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 组织研磨器或者研钵。 4.4普通冰箱：2℃~8℃。 4.5超低温冰箱：可控温至一70℃以下。 4.6 配备与移液器匹配的吸头。 4.7高压灭菌锅。 1 GB/T35912—2018 5耗材 5.11.5mL无RNA酶离心管 5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。 6试剂 6.1除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。 6.2Trizol,商品化RNA抽提试剂，4℃8℃保存。 6.3 氯仿：常温保存。 6.4吴 异丙醇：使用前预冷至一20℃。 6.5 5无水乙醇：20℃预冷 6.6 675%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，一20℃预冷。 DEPC水：配制见A.1，也可购买商品化DEPC水。 6.8 PBS:配制见A.2。 6.9 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度 为15mmol/L。 6.10逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液：逆转录酶浓度为50U/μL，一20℃保存，避免反复冻融。 6.11 RNA酶抑制剂（40U/uL）：一20℃保存，避免反复冻融 6.12 dNTPs：含dATP，dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存，避免反复冻融。 6.13 引物和TaqMan探针，其序列见附录B。 6.14猪繁殖与呼吸道综合征病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照为非感染性体外转录 RNA；阴性对照为健康猪的组织材料。 6.15内参照质粒：带有人β-珠蛋白基因的质粒。 7样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。 7.1.2注射器。 7.1.3一次性无菌采样拭子。 7.1.4组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h。 7.1.5真空采血管。 7.2 样品采集 7.2.1血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5mL，置于无菌离心管内，室温或者 37℃倾斜放置自然凝集20min～30min，2000r/min~3000r/min离心10min，吸取上清液到新的离 心管内备用。 7.2.2公猪精液：按照GB/T25172的方法采集和保存精液 7.2.3口腔拭子：大猪使用保定器保定，小猪可以双手保定，用采样拭子蘸取口腔分泌物，放人无菌采 样管中。 7.2.4肺灌洗液：完整摘取肺脏/肺叶，送实验室进行灌洗。 2 GB/T35912—2018 7.2.6细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次，第3次解冻后，将细胞培养物置于1.5mL无RNA酶的 灭菌离心管内，编号备用。 7.3样品保存和运输 7.3.1上述采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃～8℃下保存应不超过24h， 一20℃士5℃下应不超过3个月，一70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规 定温度下的保存期内送达 7.4样品处理 7.4.1血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。 7.4.2口腔拭子样品：加入500uL无菌PBS，充分涡旋震荡1min，反复挤压拭子，弃去拭子后 3000r/min离心5min，取上清用于后续的核酸提取。 7.4.3肺灌洗液：根据肺脏/肺叶的大小，通过肺管加人5mL~10mL无菌PBS，反复揉捏，吸取灌洗 液，3000r/min离心5min，取上清用于核酸提取 7.4.4组织样品：取1g组织，剪碎，加人2mL生理盐水进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心 5min，取上清用于后续的核酸提取。 7.4.5细胞培养物：4000r/min，4℃离心10min，取上清用于后续的核酸提取。 8荧光RT-PCR操作程序 8.1RNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作。RNA抽提使用Trizol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒。 8.1.2取n个灭菌的1.5mL无RNA酶离心管，其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照，对每个 离心管进行编号。 8.1.3每管先加人600μLTrizol裂解液，再分别加人被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒 10次混匀，最后加人200μL氯仿，涡旋震荡5s，4℃条件下12000r/min离心15min。 8.1.4将上层透明液体（约400μL)转移到一个新的无RNA酶的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇， 每个离心管对应编号。 8.1.512000r/min离心15min，弃去上清，沿管壁缓缓加人0.8mL~1mL75%乙醇，颠倒3~6次混 残液。 8.1.6加人20uLDEPC水，轻轻混匀，溶解RNA。提取的RNA应尽快进行反转录扩增或放置于 一70℃冰箱保存。 纸上的不同位置。 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n，n为待检样品数十阳性管数十阴性管数，每 个反应的体系见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒 中进行。 3