ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 35901—2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of porcine circovirus type 2 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35901—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司。 本标准主要起草人：张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、花群义、李树清、杨忠苹、李国新、王巧全、 王艳、林颖、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅。 GB/T 35901—2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了猪圆环病毒2型荧光PCR检测的操作方法。 本标准适用于猪圆环病毒2型核酸检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 2分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction） Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase) TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffer) PCV：猪圆环病毒（porcine circovirus） 4. 仪器设备 4.1 荧光PCR检测仪。 4.2 高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。 4.3 普通冰箱：2℃~8℃。 4.4 普通冰柜：一20℃以下。 4.5 超低温冰箱：可控温至一70℃以下。 4.6 微量移液器：0.2μL~2μL、1μL~10μL、10μL~100μL、20μL～200μL、100μL~1000μL,并 配备与移液器匹配的吸头。 4.7 高压灭菌锅。 5 耗材 5.11.5mL离心管。 5.20.2mLPCR薄壁管或八联管。 SAG 1 GB/T35901—2018 6试剂 6.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。 6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2℃～8℃保存。 6.3无水乙醇，一20℃预冷 6.475%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，一20℃预冷。 6.58mmol/LNaOH溶液，配制见附录A。 6.6PBS缓冲液（0.01mol/LPBS，pH7.4），配制见附录A。 6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/uL,Taq酶反应缓冲液中Mg2+浓度 为15mmol/L。 6.8dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，一20℃保存，避免反复冻融 6.9 引物和TaqMan探针，其序列见附录B。 6.10猪圆环病毒2型阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒， 一20℃保存备用；阴性对照可采用健康猪的组织材料。 6.11内参照质粒：带有人β-珠蛋白基因的质粒。 7样品采集和处理 7.1买 采样工具 7.1.1手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。 7.1.2组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h。 7.1.3真空采血管。 7.2 样品菜集 7.2.1血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5mL，置于无菌离心管内，室温或者 37℃倾斜放置自然凝集20min~30min，2000r/min～3000r/min离心10min，吸取上清液到新的 离心管内备用 7.2.2粪便样品采集：取猪新鲜粪便1g，装人15mL灭菌离心管中，加人5mLPBS，混匀。 7.2.3精液样品采集：按照GB/T25172的方法采集和保存精液。 7.2.4组织样品采集：采取病死猪（包括流产的死胎）或扑杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝 脏）装人灭菌15mL离心管中，编号，送实验室， 7.2.5细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次，第3次解冻后，将细胞培养物置于1.5mL无DNA酶的 灭菌离心管内，编号备用。 7.3 3样品保存和运输 一20℃士5℃可以稳定保存3个月，一70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在 规定温度下的保存期内送达。 7.4样品处理 7.4.1血清和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。 7.4.2粪便样品：3000r/min离心10min，取上清液，转入1.5mL离心管中，用于后续的核酸提取 2 GB/T35901—2018 5min，取上清用于后续的核酸提取。 7.4.4细胞培养物：4.000r/min，4℃离心10min，取上清用于后续的核酸提取。 8荧光PCR操作程序 8.1DNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作。DNA抽提使用DNAzol试剂提取，也可以使用等效商品化试剂盒提取 8.1.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照，对每个离心管进行 编号。 匀，4℃或室温10000r/min离心10min。 8.1.4取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加人500μL无水乙醇，混勾，室温放置3min； 4℃或室温10000r/min离心5min。 8.1.5弃上清，沿管壁缓缓加入0.8mL～1mL75%乙醇，颠倒3次~6次混勺，4℃10000r/min离 心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。 8.1.6用50uL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，DNA在2℃～8℃冰箱可保存两个月，一20℃冰柜 可稳定保存两年。 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n，n为待检样品数十阳性管数十阴性管数，每 个反应的体系见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n十1个反应进行配制。配制反应液在冰盒 中进行。 8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管39.8μL分装于0.2mL透明PCR管内，将 PCR管置于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。 8.2.3加样 在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加人0.2μL的内参照质粒，并分别加入8.1制备的核酸 10μLDNA溶液，盖上盖子，500r/min~1000r/min离心30s。转移至检测区 8.2.4上机检测 8.2.4.1荧光通道设置 在检测区进行。将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，设置探针：5选择FAM和 HEX两个荧光通道，3均选择无（None)。 8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段，预反应50℃/2min； 第二阶段，预变性95℃/2min； 第三阶段，变性95℃/15s，退火、延伸、荧光采集60℃/30s，40个循环； 3