ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35904—2018 旋毛虫实时荧光PCR检测方法 Real-time PCR method for detection of Trichinella spiralis 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35904—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：东北农业大学、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：宋铭忻、张子群、李雅丽、韩彩霞、王海燕、李巍、李晓云、路义鑫 GB/T 35904—2018 旋毛虫实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了旋毛虫实时荧光PCR检测的操作方法 本标准适用于家猪、野猪和犬等动物的旋毛虫核酸检测。 SZAG 规范应引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3仪器 3.1 荧光PCR仪。 3.2 高速冷冻离心机。 3.3 生物安全柜。 3.4 高压灭菌锅。 3.5 天平：精密度达0.01g以上。 3.6 组织勾浆机。 3.7 冰箱。 3.8 涡旋混合器。 3.9 研钵。 3.10 无菌离心管。 3.11 微量移液器。 4试剂 4.1 10XPCRBuffer缓冲液（无Mg²+）、rTaq酶、dNTP、Mg2+等，所有试剂均为生物试剂公司生产。 4.2 本方法试验用水符合GB/T6682规定的一级水。 5 对照样品 阳性对照样品 5.1 含有5条/g以上的国际标准种Trichinellaspiralis（T1）或Trichinellanativa（T2）旋毛虫的大鼠 肉样。 5.2 2阴性对照样品 经检测不含有旋毛虫的大鼠肉样。 1 GB/T35904—2018 6操作区域 样品处理区要有相应的生物安全设施：配液区要求高度清洁：样品处理、加样和检测区应在不同区 域进行，不同区域配备不同的加样工具和用具。 7样品采集和处理 7.1 采样部位 7.1.1家猪 横隔膜肌脚部、肋间肌、腰肌、咬肌、舌肌。 7.1.2野猪 前肢肌、隔肌。 7.1.3犬 咬肌、舌肌、排肠肌。 7.2 样品采集 根据不同种类动物体的具体情况，从采样部位各采样一块，记为一份肉样，总质量不少于50g～ 100g，与嗣体编成相同号码。 7.3 3样品处理 在样品处理区内进行，将肉样去除脂肪、肌膜或腱膜，用剪刀顺肌纤维方向，按随机采样的要求，自 肉上剪取约0.5g肉样10粒，合并成一个小样，并编号。将小样放入组织匀浆机内以3000r/min，捣碎 45s～60s，使其彻底匀浆，然后放人含有液氮的研钵中充分研磨，继续进行核酸提取，或置一20℃贮存 备用。 荧光PCR操作程序 8 8.1 DNA提取 可使用经验证的商品化组织DNA提取试剂盒提取DNA。 8.2 荧光PCR检测 8.2.1引物和探针 旋毛虫实时荧光PCR试剂：采用无DNA酶、无RNA酶的水将每条引物和探针配成100umol/L 储存液，置一20℃或更低温度冻存；使用时取适量配置成10umol/L工作液，避免多次冻融。 TCGACGATA-3';TaqMan MGB探针:5'-FAM-TTGCGACGGTTTAAA3'-NFQ-MGB。 8.2.2荧光PCR反应体系 25μL荧光PCR反应体系包括： 2 GB/T35904—2018 10XPCR反应缓冲液 2.5 μL dNTP(2.5 mmol/L) 1.5 μL Mg²+(25 mmol/L) 2.4 μL 上游引物（10μmol/L) 0.5 μL 下游引物（10μmol/L） 0.5 μL 探针(10 μmol/L) 0.3 μL rTaq酶(5 U/μL) 0.3 μL DNA模板 5.0 μL PCR用水 12.0 μL 每次试验应设标准阳性、阴性和空白对照。标准阳性用阳性对照DNA做模板，标准阴性用阴性对 照DNA做模板，空白对照用PCR用水做模板。 8.2.3 上机检测 8.2.3.1 荧光通道设置 荧光素设定：报告荧光（reportdye）设定为FAM，淬灭荧光（quenchdye）设定为None，校准荧光 （referencedye）设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数 8.2.3.2 2循环条件设置与检测 第一阶段，预变性95℃/2min； 第二阶段，变性95℃/10s，退火、延伸、荧光采集60℃/30s，共40个循环。 检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。 9结果判定 9.1质量控制 读取每个样品Ct值。标准阳性对照有特异性扩增曲线而且Ct值≤30，标准阴性对照和空白对照 无特异性扩增曲线，说明质控合格。以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新 进行。 9.2结果描述及判定 9.2.1被检样品有特异性扩增曲线，而且Ct值≤30，判定为旋毛虫核酸阳性。 9.2.2被检样品无特异性扩增曲线，判定为旋毛虫核酸阴性。 9.2.3被检样品Ct值在30～40之间，而且出现特异性扩增曲线需要重复取样检测，如重复检测的试 验结果Ct值<40，而且出现特异性扩增曲线，判定为旋毛虫核酸阳性；否则，判定为旋毛虫核酸阴性。