ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T19495.5—2018 代替GB/T19495.5—2004 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR） 检测方法 Detection of genetically modified organisms and derived products- Quantitative real-time polymerase chain reaction(PCR) methods 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19495.5—2018 前言 GB/T19495《转基因产品检测》分为如下几部分： GB/T19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义； GB/T19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求； GB/T19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法； GB/T19495.4 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法； GB/T 19495.5 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法； -GB/T19495.6 转基因产品检测 基因芯片检测方法； GB/T19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法； -GB/T 19495.8 转基因产品检测 蛋白质检测方法； GB/T 19495.9 转基因产品检测 植物产品液相芯片检测方法。 本部分为GB/T19495的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本部分代替GB/T19495.5一2004《转基因产品检测 可核酸定量PCR检测方法》。与GB/T19495.5- 2004相比，除编辑性修改外主要技术变化如下： 修改了标准的适用范围； 增加了分别基于基体标准物质以及质粒标准分子对样品中转基因植物品系进行定量检测的操 作规程； 一增加了大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、甜菜和木瓜等转基因植物品系拷贝数百分含量的 定量检测方法。 本部分由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共 和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：黄新、李想、高宏伟、凌杏园、朱水芳、陈洪俊、潘良文、曹际娟、章桂明。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T19495.5—2004。 GB/T19495.5—2018 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR） 检测方法 1范围 GB/T19495的本部分规定了大豆、玉米、油菜、水稻（大米）、棉花、马铃薯、甜菜、木瓜等植物及其 产品中转基因品系含量的实时荧光PCR定量检测方法 本部分适用于上述植物及其产品中转基因品系拷贝数百分含量的定量检测方法 SIG 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 JJF1059.1测量不确定度评定与表示 SN/T4562转基因检测实验室测量不确定度评估指南 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 转基因 transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中进 行表达，以便使该物种获得新的品种特征的技术。 3.1.2 品系特异性 event-specific 外源DNA插人受体作物基因组后经重组产生的邻接区序列。 3.1.3 实时荧光PCR real-time polymerase chain reaction 在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并通过标准 曲线对未知模板进行定量分析的方法。 3.1.4 内标准基因 endogenous reference gene 在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因。该基因可用于判定物种特异性。 1 GB/T19495.5—2018 3.1.5 Ct值cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.1.6 定量下限 limit of quantification;LOQ 在准确度和精确度处于可接受范围内时，样品中可稳定定量的分析物最低量或浓度。 3.1.7 标准物质referencematerial 具有一种或多种足够稳定、均一和确定的特性值，用以对设备进行校准、对测量方法进行评价或为 材料定值的物质或材料。 3.1.8 基体标准物质 matrix reference material 来源于植物原材料（如植物种子、叶子、根茎等），通过对转基因品系及与其对应的非转基因品种材 料通过一定质量比进行混合而制成的具有一定转基因成分百分比含量的标准物质。 3.1.9 质粒标准分子plasmidreferencemolecule 一种稳定存在的重组质粒分子，其包含了转基因检测的目标序列片段（如筛选基因片段、功能基因 片段或品系特异性片段等），以及物种特异的内标准基因片段，可用于转基因产品定性定量检测。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ACPl：酰基载体蛋白基因（acylcarrierprotein1） ADHl:乙醇脱氢酶1基因（alcoholdehydrogenase1） BHQl：黑洞猝灭基团1（blackholequencher1) bp：碱基对（basepair) Cf:采用质粒标准分子作为标准物质进行转基因成分定量检测的转换系数（conversionfactor） CHY：木瓜凝乳蛋白酶基因（chymopapaingene） CruA：油菜种子储藏蛋白基因（cruciferinAgene） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM:羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） GS：谷氨酸合酶基因（glutaminesynthasegene） Lectin：植物凝集素基因 MGBNFQ：小沟结合物无荧光猝灭基团（minorgroovebindernonfluorescentquencher） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） PLD：磷脂酶D家族基因（phospholipaseDfamilygene) ROX：一种荧光染料（carboxy-X-rhodmine) SAH7：类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因（sinapisarabidopsishomolog7gene） 2 GB/T19495.5—2018 SPS：蔗糖磷酸盐合成酶基因（sucrosephosphatesynthasegene） Taq:DNA聚合酶（TaqDNApolymerase) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris（hydroxymethyl)aminomethane UDG:尿嘧啶DNA-糖基酶（uracilDNAglycosylase) UGPase：马铃薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（UDP-glucosepyrophosphorylasegenefrom Solanum tuberosum) UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase） 4 方法原理 实时荧光PCR定量检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加人了与模板DNA匹配 的具有荧光标记的探针，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增 加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而 得到一条荧光扩增曲线。当荧光信号超过所设定的阅值（Threshold)时，荧光信号可被检测出来。 每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已 知起始拷贝数的基体标准物质或质粒标准分子可制备标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵 坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可通过制备的标准曲线计算出该样品的内标准 基因和某品系的起始拷贝数，计算出的两个目标核酸拷贝数的比值（百分数）即为测定品系的相对百分 含量。 5仪器设备和试剂 5.1仪器设备 5.1.1 样品粉碎仪或研磨机。 5.1.2 恒温孵育器或水浴锅。 5.1.3 实时荧光PCR仪。 5.1.4离心机。 5.1.5 高压灭菌锅。 5.1.6 涡旋振荡器。 5.1.7 生物安全柜。 5.1.8 核酸蛋白分析仪或紫外分光光