ICS 65. 100.10 G 25 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19567.2—2004 苏云金芽胞杆菌悬浮剂 Bacillus thuringgiensis suspension concentrate 2004-12-01实施 2004-06-22发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19567.2—2004 前言 杀虫成分是伴胞晶体中的毒素蛋白，其中，本标准所检测的对鳞翅目害虫有毒力的毒素蛋白的相对分子 量为130kDa。生物测定中甜菜夜蛾用于检测对鳞翅目贪夜蛾属害虫有特性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂 的毒力，小菜蛾和棉铃虫用于检测对其他鳞翅目害虫有活性的苏云金芽胞杆菌悬浮剂的毒力。 本标准是根据我国以往制定的苏云金芽胞杆菌行业和企业标准等有关材料，结合我国的实际情况 制定的。 本标准对苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法、抽样以及包装、运输等作了具体要求和规定，从 而为苏云金芽胞杆菌生产提供了统一的技术依据。 本标准的附录A是资料性附录，附录B是规范性附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准起草单位：农业部农药检定所、华中农业大学微生物农药国家工程研究中心、湖北省生物农 药工程研究中心。 本标准主要起草人：姜辉、喻子牛、陈守文、王开梅、王晓军、吴新平、顾宝根。 本标准由农业部农药检定所负责解释。 GB/T19567.2—2004 苏云金芽胞杆菌悬浮剂 1范围 本标准规定了苏云金芽胞杆菌悬浮剂的要求、试验方法以及标志、标签、包装、贮运 本标准适用于由用于防治鳞翅目害虫的苏云金芽胞杆菌原粉和助剂制成的苏云金芽胞杆菌悬 浮剂。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T1250极限数值的表示方法和判定方法 GB/T1600—2001农药水分测定方法 GB/T 1601 农药pH值的测定方法 GB/T 1604 商品农药验收规则 GB/T1605—2001商品农药采样方法 GB3796农药包装通则 GB/T16150—1995农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法 GB/T5451—2001 农药可湿性粉剂润湿性测定方法 3要求 3. 1 外观：棕黄色或褐色悬浮液体。 3.2苏云金芽胞杆菌悬浮剂应符合表1要求。 表1 苏云金芽胞杆菌悬浮剂控制项目指标 项 目 指 标 毒素蛋白（130kDa)/（%） 0. 6 毒力效价(P.a.,H.a.)/(IU/μL);(S.e.)/(IU/mg) 6000 pH值 4.5~6.5 悬浮率(有效成分)/（%) 80 细度（150μm）/（%） 98 注：P.a.、H.a.和S.e.分别为小菜蛾（Plutella.cylostella）、棉铃虫（Heliothisarmigera）和甜菜夜蛾（Spodopt eraerigua）缩写。 4试验方法 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液 4.1抽样 少于250mL。 1 GB/T19567.2—2004 4.2毒素蛋白含量 用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE)凝胶图像处理法进行测定。 4.2.1方法提要 用碱性溶液处理苏云金芽胞杆菌悬浮剂伴胞晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依 蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其他杂蛋白分离，用电泳图像扫描蛋白区带面积，进行定量。 4.2.2仪器、设备 a）电泳仪； b) 双垂直式电泳槽（1.5mm凹形带槽橡胶模框），凝胶板面积170mm×170mm（1.5mm、20孔 样品槽模具)； c) 电泳凝胶成像系统； d） 离心机：10000r/min； e） 分析天平：精确至0.0001g。 4.2.3试剂和溶液 4.2.3.1过硫酸铵(APS)。 4.2.3.2十二烷基硫酸钠(SDS)。 4.2.3.3四甲基乙二胺(TEMED)。 4.2.3.4氢氧化钠。 4.2.3.530%丙烯酰胺凝胶母液：称取丙烯酰胺30g，亚甲基双丙烯酰胺（原称：甲叉双丙烯酰胺） 0.8g，溶于100mL蒸留水中，过滤，于4℃暗处贮存备用。 4.2.3.6分离胶缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲烷（Tris)18.17g和SDS0.4g溶于蒸馏水中，用浓盐 酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至100mL。 4.2.3.7浓缩胶缓冲液：称取Tris6.06g和SDS0.4g溶于蒸馏水中，用浓盐酸调至pH6.8,用蒸馏 水定容至100mL。 4.2.3.8电极缓冲液：称取Tris3.036g，甘氨酸14.42g.SDS1g，用水溶解并定容至1000mL。 4.2.3.93X样品稀释液：1mol/L、pH6.8Tris-HCl18.75mL,SDS6g，甘油30mL，巯基乙醇 15mL，少许溴酚蓝，用蒸馏水定容至100mL。 4.2.3.10固定液：量取95%乙醇500mL，冰乙酸160mL，用蒸馏水定容至1000mL。 4.2.3.11染色液：称取考马斯亮蓝（CBB)R-2501g，加人95%乙醇250mL，冰乙酸80mL，蒸馏水定 容至1000mL，溶解过滤后使用。 4.2.3.12脱色液：量取95%乙醇250mL，冰乙酸80mL，用蒸馏水定容至1000mL。 4.2.3.13毒素蛋白标样：毒素蛋白（相对分子量为130kDa）含量为8.0%的原粉。 4.2.4样品处理 将试样摇勾后取100L加入一1.5mL离心管，加人0.5mol/L氢氧化钠溶液25uL（使氢氧化 钠溶液的终浓度为0.1mol/L），放置5min；称取标样20.0mg（准确到0.1mg），移至1.5mL离心管 中，加1mL水充分悬浮，取100μL加人另一1.5mL离心管，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液25μL（使 氢氧化钠溶液的终浓度为0.1mol/L），放置约5min。分别向上述标样和试样中加人3X样品稀释液 75μl，使最终体积为200μL，于100℃沸水中煮沸6min，离心（2000r/min）10min后取上层清液，以 备电泳上样。 4.2.5SDS-PAGE分离毒素蛋白 4.2.5.1制备7.5%聚丙烯酰胺凝胶 采用不连续缓冲系统，制胶方法见附录A（资料性附录）。 4.2.5.2上样 取上述标样溶解液上层清液，于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样6、8、10、12、14L（毒素蛋白 2 GB/T19567.2—2004 含量约为3μg～7ug），作为标准曲线；再取一定体积的试样溶液上层清液（毒素蛋白含量约为5μg），加 入到上样孔中，注人电极缓冲液后，接通电源。 4.2.5.3电泳 沿到达距底端1cm左右时停止电泳，取出胶板，在7.5%（体积分数）乙酸中浸泡30min。 4.2.5.4染色 将分离胶部分取下，用考马斯亮蓝（CBB)R-250染色液染色过夜。 4.2.5.5脱色 倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加人脱色液，于37℃恒温脱色，更换儿次脱色液，至背景清 晰为止。 4.2.6测定 胶板经脱色后，可清晰地看到分子量为130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统对凝胶进行分析 样品中毒素蛋白的百分含量（X)按式（1)进行计算。 X= XnX100% ...(1) cXV 式中： M由标准蛋白回归曲线计算得到的蛋白量； c——样品的浓度； V-—样品的加样体积； n—样品的稀释倍数。 4.2.7允许差 取其算术平均值为测定结果。两次平行测定结果相对偏差小于等于5%。 4.3毒力效价的测定 按附录B（规范性附录）进行。 4.4pH值的测定 按GB/T1601测定。 4.5细度的测定 按GB/T16150—1995中2.2进行测定。 4.6悬浮率测定 4.6.1仪器、试剂 a）量筒：250ml，具塞； 吸液管； c）秒表； d) 三角瓶：500mL，100mL； 恒温水浴锅； f) 标准硬水：配制方法按GB/T5451一2001中标准硬水配制方法进行。 4.6.2操作步骤 将样品摇匀后取5.00mL（精确到0.01mL），于100mL三角瓶中，加人标准硬水100mL，用手左 右振荡50次。制得的悬浮液移到250mL具塞量筒中，用标准硬水稀释到250mL。 将量筒放入30℃土1℃恒温水浴锅中，当悬浮液温度达到30℃时，将量筒盖好，拿起量筒先轻轻摇 起沉淀物，然后有规律的以量简中部为中心上下颠倒30S，使呈均匀的悬浮液，量简仍放入恒温水浴中， 打开盖子，静置30min，用吸液管以抽气法将量筒上部9/10的悬浮液抽出（在15s～30s内完成）。抽 液过程中，吸液管应依附筒壁随液面下降而下降，勿搅动下部沉淀。该供试悬浮剂及量简内剩下的 3