ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T15805.5—2018 代替GB/T15805.5—2008 鲤春病毒血症诊断规程 Protocol of diagnosis for spring viraemia of carp 2019-07-01实施 2018-12-28发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T15805.5—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T15805.5—2008《鱼类检疫方法第5部分：鲤春病毒血症病毒（SVCV）》。与 GB/T15805.5一2008相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 一增加了缩略语； 一增加了酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）检测鲤春病毒血症 病毒（springviraemiaofcarpvirus，SVCV）抗原的方法； 一增加了间接免疫荧光抗体试验（indirectimmunofluorescentantibodytest，IFAT）检测SVCV 抗原的方法； 增加了实时定量PCR(real-timePCR）检测SVCV核酸的方法； 增加了鲤春病毒血症（springviraemiaofcarp，SVC)的综合判定 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：宁波市海洋与渔业研究院、全国水产技术推广总站、中华人民共和国北京海关、中 华人民共和国蛇口海关。 本标准主要起草人：王建平、张利峰、江育林、徐胜威、高隆英、吴雄飞、陈爱平、沈伟良 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T15805.1—1995; GB/T15805.52008。 1 GB/T15805.5—2018 鲤春病毒血症诊断规程 1范围 本标准规定了鲤春病毒血症的采样、病毒分离培养、RT-PCR、实时定量RT-PCR、酶联免疫吸附试 验、间接免疫荧光抗体试验、综合判定的方法 本标准适用于鲤春病毒血症的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CO:草鱼卵巢细胞系（grass carp ovarycell line) CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect） EB：漠化乙锭（ethidiumbromide） ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） EPC：鲤上皮瘤细胞系(epitheliomapapulosumcyprinicellline) FCS:胎牛血清(fetal calf serum) FHM：胖头鳞肌肉细胞系（fatheadmonnowcellline） FITC：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） G蛋白：糖蛋白（glycoprotein） IFAT：间接免疫荧光抗体试验（indirectimmunofluorescentantibodytest) RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction） SVC:鲤春病毒血症（springviraemia of carp) SVCV：鲤春病毒血症病毒（springviraemia of carpvirus） 4 试剂和材料 4.1 水：符合GB/T6682中一级水的规格；核酸抽提和RT-PCR应使用无RNA酶的去离子水。 4.2 SVCV参考株：由中华人民共和国农业农村部相关部门指定单位提供。 4.3 鱼类细胞系：EPC、FHM、CO。 鱼类细胞生长液：用Earle's平衡盐的M199培养基配制，另加10%胎牛血清（FCS）。 4.5 鱼类细胞维持液：用Earle's平衡盐的M199培养基配制，另加2%FCS。 4.6 细胞消化液：见附录A中A,1。 1 GB/T15805.5—2018 4.7 HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）。 4.8 逆转录酶AMV：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.9 RNA酶抑制剂（RNasin或RNaseInhibitor）：一20o℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.10J RT-PCR逆转录酶浓缩缓冲液、Taq酶用浓缩缓冲液：分别见A.2、A.3。 4.11 MgCl2 :25 mmol /L. 4.12 dNTP:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L,一20℃保存。 4.13 Taq酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.14无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.15 DNA Marker 2000. 4.16 琼脂糖。 4.17 TBE电泳缓冲液：见A.4。 4.18 引物和探针：参照OIE《水生动物疾病诊断手册》2016年版，SVCV糖蛋白（G蛋白）基因片段（参 见附录B)及SN/T1152。RT-PCR和实时定量RT-PCR检测SVCV的引物和探针如下： PCR扩增SVCVG蛋白714bp片段的引物，嵌套PCR扩增606bp片段的引物。使用时浓度 a)I 为40μmol/L。引物按以下序列合成： RT-PCR引物： 正向引物 F1:5'-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR-RTC-3'; 反向引物R2:5'-AGA-TGG-TAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH-ACN-CAY-3'; 嵌套PCR引物： 正向引物F1:5'-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR-RTC-3'; 反向引物R4:5'-CTG-GGG-TTT-CCN-CCT-CAA-AGY-TGY-3'。 b）实时定量RT-PCR检测SVCV的引物和探针，按以下序列合成： 引物 391ul:5'-ATC-ATT-CAA-AGG-ATT-GCA-TCA-G-3'; 引物 391r1:5'-CAT-ATG-GCT-CTA-AAT-GAA-CAG-AA-3'; 探针:5-(FAM)-TCC-CCC-TCA-AAG-TTG-CGG-ATG-G(TAMRA)-3。 4.19 包被稀释液：pH9.6、0.02mol/L的碳酸盐缓冲液（见A.5）。 4.20羊抗SVCV免疫球蛋白（Ig）：由中华人民共和国农业农村部有关部门指定机构提供，并经过实验 确认。 4.21鼠抗SVCV的单克隆抗体：由中华人民共和国农业农村部有关部门指定机构提供，并经过实验 确认。 4.22 辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗鼠抗体。 SAC 4.23 封闭液：1%明胶（用包被液配制）。 4.24 终止液：2mol/L的硫酸 4.25 异硫氰酸荧光素（FITC)标记的抗鼠抗体。 4.26 样品缓冲液：见A.6。 5器材和设备 5.1 倒置显微镜。 5.2生化培养箱。 5.3普通冰箱和超低温冰箱。 5.4组织研磨器。 5.5冷冻离心机和离心管。 2 GB/T15805.5—2018 5.6 6PCR仪、荧光PCR仪。 5.7 电泳仪。 5.8 微量移液器， 5.9 紫外透射仪或凝胶成像仪。 5.10 高压灭菌锅。 5.11 微波炉 5.12 水浴锅。 5.13 制冰机。 5.14 磁力搅拌器。 5.15 过滤系统。 5.16 酶标仪和洗板机。 5.17 24孔、96孔细胞培养板，细胞培养瓶 6 临床症状 参见附录C。 7采样 7.1采样对象 根据SVCV宿主易感性，优先米集鲤；次选杂交鲤（如鲤和鲫的杂交品种）和鲫、金鱼、草鱼、、鲢 等其他鲤科鱼类，最后是易感的非鲤科鱼类。 7.2采样水温与数量 采样应在水温低于22℃进行，采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3 3样品菜集 体长<4cm的鱼去头和尾后取整条鱼；体长为4cm～6cm的鱼，取内脏（包括肾）；体长>6cm的 鱼则取脑、肝、肾和脾，各器官、组织大致等量收集。 8病毒分离和鉴定 8.1病毒分离培养 8.1.1样品处理 最多5尾鱼为1个样品，样品匀浆，用含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的鱼细胞 生长液1：10稀释，混勾悬浮。于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h。7000r/min，4℃离 心15min，收集上清液 8.1.2病毒分离 SAG 100μL。接种后的细胞板置于20℃土2℃培养7d。接种的细胞板需设2孔阳性对照（接种SVCV参 3