UDC668.58:576.85.07 GB C 51 中华人民共和国国家标准 GB 7918.4—87 化妆品微生物标准检验方法 绿脓 杆菌 Standard methods of microbiological examination for cosmetics Pseudomonas aeruginosa 1987-05-28发布 1987-10-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中华人民共和国国家标准 UDC 668. 58 : 576 .85.07 化妆品微生物标准检验方法 GB 7918.4 绿脓 杆菌 87 Standard methods of microbiological examination for cosmetics Pseudonpnas aeruginosa 绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染， 特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中 规定不得检出绿脓杆菌。 1方法提要 根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌,氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶,还原硝 酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。 2 培养基和试剂 2. 1 SCDLP 液体培养基 见GB7918.1一87《化妆品微生物标准检验方法总则》。 2.2十六烷三甲基溴化铵培养基 成分：牛肉宵 3g 蛋白陈 10g 氯化钠 5g 十六烷三甲基溴化铵 0. 3g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 制法：除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调pH为7.4~～7.6，加入琼脂，115℃（101b）20min灭菌 后，制成平板备用。 2.3乙酰胺培养基 10. 0g 成分：乙酰胺 氯化钠 5. 0g 1.39g 无水磷酸氢二钾 无水磷酸二氢钾 0.73g 硫酸镁(MgS 0, ·7H,0) 0. 5g 0. 012g 酚红 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 制法;除琼脂和酚红外,将其他成分加到蒸水中，加热溶解，调pH为7.2,加入琼脂、酚红，121℃ 中华人民共和国卫生部1987-05-28批准 1987-10-01实施 1 GB 7918. 4—87 (15 1b)20 min 高压灭菌后,制戒平板备用。 2.4绿脓菌色素测定用培养基 成分：蛋白陈 20g 氯化镁 1. 4g 硫酸钾 10g 琼脂 18g 甘油（化学纯） 10g 蒸馏水 1000ml 制法：将蛋白陈、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中，加温使溶解，调pH至7.4，加入琼脂和甘油，加热 溶解，分装于试管内,115℃(101b)20min高压灭菌后，制成斜面备带。 2.5明胶培养基 成分：牛肉膏 3g 蛋白陈 5g 明胶 120g 蒸馏水 1000ml 制法：取各成分加在蒸馏水中浸泡20min，随时搅拌加温使溶解，调pH至7.4，分装于试管内，经 115℃(10 Ib)20 min 灭菌后,直立制成高层备用。 2.6硝酸盐蛋白膝水培养基 成分：蛋白 10g 酵母浸膏 3g 硝酸钾 2g 亚硝酸钠 0. 5g 蒸馏水 1000ml 制法:将蛋白陈和酵母浸膏加到蒸馏水中,加温使溶解,调 pH 为 7. 2,煮沸过滤后补足液量,加入硝 酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀,分装到加有小衛管的试管中，115℃(10 1b)20 min灭菌后备用。 2.7普通琼脂斜面培养基 成分：蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 15g 蒸馏水 1000ml 制法:除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调pH 为7.2～7.1,加入琼脂，加热溶解，分装试管, 121℃（151b)15min高压灭菌后，制成斜面备用。 3仪器 3.1培养箱：37℃、12℃。 3.2锥形烧瓶。 3. 3 试管。 3.4灭菌平。 3.5灭菌刻度吸管。 3.6显微镜， 3.7载玻片。 3. 8 接种针、接种环。 2 GB 7918.4—87 3.9电炉。 3.10高压消毒锅。 4操作步骤 4.1增菌培养：取1：10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37C培养18～24h。 如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。 注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉荡培养基。检验含防腐剂的化妆品时，在每1000 m1 普通内汤中*加Ig 卵 磷脂、7g吐温 80。 4.2分离培养：从培养的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置 37℃培养18～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无楚型，间周边扩散或略有蔓延，表面湿润， 氏阳性菌生长较差。 在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平Ⅲ中，放 37℃培养21h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁苹，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其 他菌不生长。 4.4氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌 落涂在滤纸片上，然后在其上滴加-一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15～30s之内，出现粉红 色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。 4.5绿脓菌素试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37C培养24h，加 入氯仿3～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯 仿移到另一试管中并加入 1N的盐酸1 ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红 色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。 4.6硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物.接种在硝酸盐陈水培养基中，置37C培养24h，观 察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝 酸盐分解产生氮气 4.7明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h， 4.842C生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养 24~48h,绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。 5检验结果报告 被检样品经增菌分离培养后·经证实为革兰民阴性柱茵，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可 报告被检样品中检山有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验 三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿杆菌。 附加说明; 本标准出中国预防医学科学院环境卫生监测所门。 本标准由“化妆品微生物标雅检验方法”起草小组起草。 本标准主要起草人周淑玉。 本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。 3 GB 7918.4—87 3.9电炉。 3.10高压消毒锅。 4操作步骤 4.1增菌培养：取1：10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37C培养18～24h。 如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。 注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通肉荡培养基。检验含防腐剂的化妆品时，在每1000 m1 普通内汤中*加Ig 卵 磷脂、7g吐温 80。 4.2分离培养：从培养的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置 37℃培养18～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无楚型，间周边扩散或略有蔓延，表面湿润， 氏阳性菌生长较差。 在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平Ⅲ中，放 37℃培养21h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁苹，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其 他菌不生长。 4.4氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌 落涂在滤纸片上，然后在其上滴加-一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液，在15～30s之内，出现粉红 色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。 4.5绿脓菌素试验：取可疑菌落2～3个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置37C培养24h，加 入氯仿3～5ml，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氯仿液内，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯 仿移到另一试管中并加入 1N的盐酸1 ml左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红 色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。 4.6硝酸盐还原产气试验：挑取被检的纯培养物.接种在硝酸盐陈水培养基中，置37C培养24h，观 察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝 酸盐分解产生氮气 4.7明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h， 4.842C生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养 24~48h,绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。 5检验结果报告 被检样品经增菌分离培养后·经证实为革兰民阴性柱茵，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可 报告被检样品中检山有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验 三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿杆菌。 附加说明; 本标准出中国预防医学科学院环境卫生监测所门。 本标准由“化妆品微生物标雅检验方法”起草小组起草。 本标准主要起草人周淑玉。 本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。 3