UDC 668.58:576.85.07 GB C 51 中华人民共和国国家标准 GB 7918.3—87 化妆品微生物标准检验方法 粪大肠菌群 Standard methods of microbiological examination for cosmetics Fecal coliforms 1987-05-28发布 1987-10-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 中华人民共和国国家标准 UDC 668. 58 : 576 .85.07 化妆品微生物标准检验方法 粪大肠菌群 GB 7918. 3-~87 Standard methods of microbiological examinatlon for cosmetics Fecal collforms 粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便。检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可 能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险。因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。 1方法提要 根据粪大肠菌群所具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌在 44℃培养 24~48h 能发酵乳糖产 酸并产气·能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生靛基质。 2 培养基和试剂 2. 1乳糖胆盐培养基 成分：蛋白陈 20g 猪胆盐 5g 乳糖 5g 0. 4%溴甲酚紫水溶液 2.5ml 蒸馏水 1000mi 制法：将蛋白陈、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中调pH到7.4,加入指示剂，混匀，分装试管(每支试管中 加一个小倒管）。115℃(10 lb)20min灭菌。 2. 2双倍浓度乳糖胆盐培养基 按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸馏水量不变，其他成分量加倍。 2.3伊红美蓝(EMB)琼脂 成分，蛋白陈 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20g 2%伊红水溶液 20ml 0.5%美蓝水溶液 13m1 蒸馏水 1000ml 制法：先将琼脂加到900ml蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾蛋白炼，混匀，使之溶解。再 以蒸馏水补足至 1010ml。校正 pH值为 7.2～7.4,分装于烧瓶内，121℃(15 1b)15 min高压灭菌备用。 临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇勾。倾注平 血备用。 中华人民共和国卫生部 1987-05-28批准 1987-10~01 实施 1 GB 7918.3—87 2. 4蛋白陈水（作靛基质试验用） 成分：蛋白陈(或胰蛋白陈） 20g 氯化钠 58 蒸馏水 1000ml 制法：将上述成分加热熔化,调pH值为7.0~～7.2,分装小试管,高压灭菌 121℃(15Ib)15min。 2.5靛基质试剂 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25ml。 试验方法：接种细菌于蛋白陈水中，于44C培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.3～0.5ml，轻摇试 管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。 注：蛋白应含有丰富的色氨酸，每批蛋白买米后，应允用凹知菌种鉴定后方可使用。 2.6革兰氏染色法 2.6.1染液制备 2.6.1.1结晶紫染色液： 结晶紫 1g 95%酒精 20ml 1%草酸铵水溶液 将结晶紫溶于酒精中，然后与草酸铵溶液混合。 2.6.1.2革兰氏碘液： 碘 1g 碘化钾 2g 燕馏水 300ml 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水牵300ml。 2.6.1.3脱色液：95%乙醇。 2.6.1. 4复染液; a、沙黄复染液: 沙黄 0. 25g 95%酒精 10ml 蒸馏水 [u06 将沙黄溶解于酒精中，然后用蒸馏水稀释。 b.稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g，研细，加95%乙醇100ml，放置过夜，滤纸过滤。取该液 10ml，加5%石碳酸水溶液90ml混合，即为石碳酸复红液。再取此液10ml加水90ml，即为稀石碳酸复 红液。 2.6.2染色法 2.6.2.1将涂片在火焰上冏定,滴加结晶紫染色液,染 1 tnin,水洗。 2.6.2.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。 2.6.2.3滴加95%酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即倾去，再用酒精滴满整个涂片，脱 色 10s,水洗。 2.6.2.4滴加复染液，复染1min,水洗，待干，镜检。 2.6.3染色结果 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 注:如用 1：10 稀释石碳酸复红染色液作复染液,复染时间仪需 10s。 3 仪器 3.1恒温水浴或隔水式恒温箱:44℃。 2 GB 7918.3—87 3. 2 温度计。 3.3显微镜。 3.4载玻片。 3.5接种环。 3.6电炉。 3.7锥形瓶。 3.8试管。 3.9小倒管。 3. 10 pH 计或 pH 试纸。 3. 11 高压消毒锅。 3. 12 灭菌吸管。 3. 13灭菌平血。 4操作步骤 4.1取10ml1：10稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃培养箱中培养 21~48h,如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。 4.2如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37C培养18～24h。同时取该培养液1～2滴 接种到蛋白陈水中,置 44℃培养 24h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落 呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的紫黑色，不带或略带金光泽， 或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。 4.3挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。 4.4在蛋白陈水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml,观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴 性反应液面呈试剂本色。 5检验结果报告 平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪 大肠菌群。 附加说明： 本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。 本标准主要起草人周淑玉。 本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。 3 GB 7918.3—87 3. 2 温度计。 3.3显微镜。 3.4载玻片。 3.5接种环。 3.6电炉。 3.7锥形瓶。 3.8试管。 3.9小倒管。 3. 10 pH 计或 pH 试纸。 3. 11 高压消毒锅。 3. 12 灭菌吸管。 3. 13灭菌平血。 4操作步骤 4.1取10ml1：10稀释的样品，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44℃培养箱中培养 21~48h,如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。 4.2如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37C培养18～24h。同时取该培养液1～2滴 接种到蛋白陈水中,置 44℃培养 24h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落 呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的紫黑色，不带或略带金光泽， 或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选。 4.3挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。 4.4在蛋白陈水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml,观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴 性反应液面呈试剂本色。 5检验结果报告 平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出粪 大肠菌群。 附加说明： 本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。 本标准主要起草人周淑玉。 本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。 3