ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T18936—2020 代替GB/T18936—2003 高致病性禽流感诊断技术 Diagnostic techniques for highly pathogenic avian influenza 2020-12-14实施 2020-12-14发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T18936—2020 目 次 前言 范围 1 规范性引用文件 2 术语和定义 临床诊断 5 样品采集、保存与运输 6 病毒分离与鉴定 血凝和血凝抑制试验 7 禽流感病毒 RT-PCR试验 禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验 10综合判定 附录A（规范性附录） 试验所用溶液和1%鸡红细胞的配制 附录B（资料性附录） 高致病性禽流感病毒IVPI测定试验 附录C（资料性附录）血清非特异性凝集和非特异性抑制因子的处理方法 10 附录D（资料性附录） 禽流感病毒RT-PCR试验用引物· 12 附录E（资料性附录） RT-PCR反应液配制 附录F（资料性附录）实时荧光RT-PCR引物探针序列及反应液配方 GB/T18936—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T18936—2003《高致病性禽流感诊断技术》，与GB/T18936—2003相比，主要技 术变化如下： 一增加了禽流感病毒RT-PCR试验（见第8章）； 一增加了禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验（见第9章）； 一删除了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）（见2003年版的第5章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中华人民共和国北京海关、中国动物卫生与 流行病学中心。 本标准主要起草人：王秀荣、田国彬、刘环、邓国华、蒋文明、施建忠、曾显营、李雁冰、谷强、孙晓东、 陈化兰。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18936—2003。 1 GB/T18936—2020 高致病性禽流感诊断技术 1范围 本标准规定了高致病性禽流感临床诊断，样品采集、保存与运输，病毒分离与鉴定，血凝和血凝抑制 试验，禽流感病毒RT-PCR试验和禽流感病毒实时荧光RT-PCR试验的技术要求。 本标准适用于高致病性禽流感的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T765高致病性禽流感样品采集、保存及运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 高致病性禽流感highlypathogenicavianinfluenza;HPAI 由正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的急性传染病。 3.2 血凝hemagglutinin;HA 流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白，具有识别红细胞表面受体并使红细胞凝集的特性。 3.3 血凝抑制hemagglutinin inhibition；HI 抗体特异性地附着在HA分子的抗原位点上，干扰流感病毒HA与红细胞受体之间的结合，抑制 了流感病毒HA凝集红细胞的能力。 3.4 反转录聚合酶链式反应 reverse transcription-polymerase chain reaction;RT-PCR 种用于放大扩增特定的RNA片段的分子生物学技术。先用RNA反转录为cDNA，然后以 cDNA为模板进行PCR扩增的过程。 3.5 5Z1G 实时荧光RT-PCRreal-timeRT-PCR 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程的一种扩增核酸方法。 3.6 Ct 值 Icycle threshold 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数。 1 GB/T18936—2020 4临床诊断 4.1 易感动物 鸡、火鸡、鸭、鹅、鹑、雉鸡、鹧鸪、驼鸟、孔雀等多种禽类易感，多种野鸟也可感染发病 4.2临床症状 4.2.1精神沉郁，嗜睡，头翅下垂，呆立；食欲不振；呼吸困难，有呼吸道症状 4.2.2鸡冠发、发紫；眼结膜发红；排黄、白、绿色稀便，并有未完全消化的饲料；脚鳞或有出血。 4.2.3产蛋下降，软壳蛋、畸形蛋增多；有歪脖子等神经症状。 4.2.4鸭、鹅等水禽可见神经和腹泻症状；有时可见角膜发红、充血、有分泌物，甚至失明 4.3 剖检变化 4.3.1气管弥漫性充血、出血，有少量黏液；肺部有炎性症状。 4.3.2腹腔有浑浊的炎性分泌物；肠道可见卡他性炎症；输卵管内有浑浊的炎性分泌物，卵泡充血、出 血、萎缩、破裂，有的可见“卵黄性腹膜炎”；胰腺边缘有出血、坏死。 4.3.3心冠及腹部脂肪出血；腺胃乳头可见出血；盲肠扁桃体肿大出血；直肠黏膜及泄殖腔出血。 4.4 结果判定 出现4.2、4.3中的情况，初步判为高致病性禽流感临床疑似病例，需要进一步开展实验室诊断。 5样品采集、保存与运输 5.1总则 样品采集、保存及运输应按照NY/T765进行。样品采集宜在发病初期、选择具有典型临床症状的 禽进行，采样过程中应避免交叉污染。死禽或其他动物采集气管、肺和脑等组织样品，进行分别处理；活 禽样品应包括咽喉和/或泄殖腔拭子；小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便 5.2拭子样品 5.2.1采集咽喉拭子时将子深入喉头及上颚裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液。 5.2.3将采样后的拭子分别放入盛有1.2mL样品稀释液（配制方法见附录A中的A.1)的2mL采样 管中，编号并填写相应采样单。 5.3 组织样品 发病禽鸟可无菌采集气管、肺、脑、肠（包括内容物）、肝、脾、肾、心等组织脏器，装入15mL或 50mL带螺口的有机材料保存管中，编号并填写相应采样单。 5.4血清样品采集 无菌采集禽类的血液，每只约2mL，编号并填写相应采样单。待血液凝固，血清析出后，收集血清 用于HI检测。 2