ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T 17819—2017 代替GB/T17819—1999 添加剂预混合饲料中维生素B12的测定 高效液相色谱法 Determination of vitamin B2 in additive premix High performance liquid chromatography 2018-05-01实施 2017-11-01发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 17819—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T17819—1999《维生素预混料中维生素B12的测定 高效液相色谱法》。与 GB/T17819—1999相比，主要技术内容差异如下： 标准名称改为《添加剂预混合饲料中维生素Bi2的测定 高效液相色谱法》。 删除1999年版中附录A。 增加资料性附录A。 一在范围和方法中删除维生素B12预混制剂的测定 -将1999年版中方法进行了修改，补充固相萃取净化处理方法。 补充了使用C18色谱柱的色谱参考条件。 增加了对标准工作液的赋值方法。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 （北京）。 本标准主要起草人：索德成、李兰、赵小阳、虞哲高。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T17819—1999。 1 GB/T17819—2017 添加剂预混合饲料中维生素B12的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了添加剂预混合饲料中维生素B12含量测定的高效液相色谱方法。 本标准适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素B12的测定 本标准的方法检出限为0.1mg/kg，定量限为0.5mg/kg。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样中维生素B12用水提取，经SPE净化富集后，采用高效液相色谱仪分离检测，外标法定量。 4试剂和溶液 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，色谱用水应满足GB/T6682中一级水的要求。实验 用水应满足GB/T6682中三级水的要求 4.1乙腈：色谱纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3金 氮气（纯度99.9%）。 4.4 乙酸：优级纯。 4.5 已烷磺酸钠：色谱级。 4.6维生素B12标准品：维生素B12含量≥96.0%。 4.7维生素Bi2标准储备溶液：准确称取0.1g（精确到0.0001g）维生素B12标准品（4.6），置于100mL 棕色容量瓶中，加适量的甲醇（4.2)使其溶解，并稀释定容至刻度，摇匀。该标准储备液维生素B12含量 为1mg/mL。一18℃保存，有效期一年。 用水定容稀释至刻度，摇匀。 维生素B12标准工作液的浓度按下述方法测定和计算： 以水为空白溶液，用紫外分光光度计测定维生素B12标准工作液在361nm处的吸光值。维生素 Bl2标准工作液的浓度X以微克每毫升（ug/mL）表示，按式（1）计算： 1 GB/T178192017 ..(1) 207 式中： A 一—维生素Bi2标准工作液在361nm波长处测得的吸光值； 10000——维生素B12标准工作液浓度单位换算系数； 207——维生素B12标准百分系数（Elm=207）。 也可根据实验需要配置相应浓度的标准工作液 4.9已烷磺酸钠溶液：称取1.1g已烷磺酸钠（4.5）溶于1000mL水中，加入10mL乙酸（4.4），超声 混匀。 4.101%磷酸溶液：取1mL磷酸加人1000mL水中，超声脱气。 5仪器和设备 5.1实验室常用仪器、设备。 5.2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。 5.3 离心机：可达5000r/min（相对离心力为2.988g）。 5.4超声波水浴。 5.5 固相萃取装置。 5.6 高效液相色谱仪：配紫外可调波长检测器（或二极管矩阵检测器）。 5.7 氮吹装置。 5.8 紫外分光光度计。 5.9 C18固相萃取小柱：500mg/6mL或相当性能的固相萃取小柱。 6采样和试样制备 按照GB/T14699.1抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按照GB/T20195制备试样， 磨碎，全部通过0.25mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光保存备用。 7分析步骤 7.1提取 7.1.1维生素预混合饲料的提取 称取试样2g~3g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，准确加人水20mL，充分摇动30s，再 置于超声水浴中超声提取30min，期间摇动2次。于离心机上5000r/min离心5min，取上清液，如果 样品溶液为含量大于10mg/kg的维生素预混料，则过0.45μm微孔滤膜，上HPLC测定。若测得样品 100ug/mL，应根据检测结果，用一定体积的水稀释，使稀释后维生素Bi2的含量在2ug/mL～ 100μg/mL之间，重新测定。 7.1.2复合预混合饲料的提取 称取试样2g~3g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，准确加人水20mL，充分摇动30s，再 置于超声水浴中超声提取30min，期间摇动2次。于离心机上5000r/min离心5min，取上清液，进行 2 SAG GB/T17819—2017 下一步净化。 7.2 2试样净化 固相萃取小柱分别用5mL甲醇和5mL水活化，准确移取10mL上清液（7.1）过柱，用5mL水淋 洗，近干后，用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液。50℃氮气吹至近干，准确加入1mL水溶解，过0.45um 微孔滤膜，上HPLC测定。若测得上机试样溶液中维生素B12浓度超出线性范围，应根据检测结果，用 一定体积的水稀释，使稀释后维生素Bi2的含量在1μg/mL100μg/mL之间，重新测定。 7.3测定 7.3.1参考色谱条件 7.3.1.1 氨基柱 色谱柱：氨基柱，长250mm，内径4mm，粒度5μm（或相当性能类似的分析柱）； 流动相：乙腈+1%磷酸水（25+75）； 流速：1.0 mL/min; 温度：室温； 检测波长：361nm。 7.3.1.2 2Ci柱 色谱柱：Cls型柱，长150mm，内径4.6mm，粒度5μm（或相当性能类似的分析柱）； 流动相：甲醇十已烷磺酸钠溶液（25十75）； 流速:1.0 mL/min; 温度：室温； 检测波长：546nm。 7.3.2定量测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱柱注入相应的维生素Bi2标准工作液（4.8）和 试样溶液，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定，维生素B12标准色谱图参见附录A。 8 3结果计算 试样中维生素Bi2的含量，以质量分数X计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（2）计算： PiXVXC ...(2) P,Xm 式中: P1——试样溶液峰面积值； V一一稀释体积，单位为毫升（mL）； C—维生素Bi2标准工作液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； P—一维生素B12标准工作液峰面积值； 试样质量，单位为克（g）。 m 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。 3