ICS 07.080 CCS A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38488—2021 微生物快速测定方法 Rapid determination of microorganisms 2022-07-01实施 2021-12-31发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38488—2021 前言 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由中国标准化研究院提出并归口。 本文件起草单位：北京出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中国标准化研究院、天津海关工业产 品安全技术中心、江汉大学、北京工商大学、武汉旭东食品有限公司、北京萨姆伯科技有限公司、华测检 测认证集团北京有限公司、中国农业大学。 本文件主要起草人：张捷、马爱进、柳明、赵琢、彭海、畅晓晖、张园、贾英民、高欣、杨向莹、张惠媛、 何旭东、郝帅、李小林、董立雅、张昊、王华、陈广全、彭彦昆 1 GB/T 38488—2021 微生物快速测定方法 1范围 本文件规定了用分子马达法、近红外免疫层析法和目标区域测序法快速测定微生物的方法。 本文件中第一法一一分子马达法适用于食品和生活饮用水中单核细胞增生李斯特氏菌（L.mono cytogenes）、副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus）、霍乱弧菌（Vibriocholerae）、沙门氏菌（Salmonel- la）、阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）（Cronobactersakazakii）、志贺氏菌（Shigella）、甲型肝炎病毒 （HepatitisAvirus，HAV)的快速测定；第二法—近红外免疫层析法适用于食品和生活饮用水中单 核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、轮状病毒（Rotavirus）、诺如病毒（Noro irus）、甲型肝炎病毒的快速测定；第三法目标区域测序法适用于食品和生活饮用水中沙门氏菌、 志贺氏菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶耳森氏菌（Yersinia enterocolitica）、空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）、单核细胞增生李斯特氏菌、肠出血性大肠杆菌 O157：H7（EnterohemorrhagicE.coliO157）、霍乱弧菌、阪崎克罗诺杆菌（阪崎肠杆菌）创伤弧菌 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 3 本文件没有需要界定的术语和定义。 4分子马达法 4.1原理 ATP合成酶属于一种旋转型分子马达，由跨膜质子（H+）梯差驱动，其上的ε亚基为转子，转子负 载越大，分子马达转速越低、跨膜转运的质子（H+）数量越少。在ATP合成酶的e亚基上连接e亚基抗 体-链霉亲和素-生物素-核酸探针（见附录A表A.2），当探测到目标病原微生物特异性基因序列并与其 结合时，分子马达的转速变化可以间接地通过载色体（chromatophore）膜外标记的对pH敏感的荧光探 针1,2-双十六烷基-3-甘油-磷酸乙醇胺（DHPE)来检测，从而实现对目标病原微生物的定性测定。 4.2试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.2.1水：GB/T6682中一级水。 4.2.2DNA提取试剂盒。 1 GB/T38488—2021 4.2.3RNA提取试剂盒。 4.2.4分子马达检测试剂盒：见表A.1。 4.2.5荧光素酶溶液：将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加人装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖 上瓶塞反复颠倒混匀，不可振荡。 4.2.6异硫氰酸胍溶液：6mol/L。 4.2.7 阳性对照：以标准菌株或病毒提取DNA，作为阳性对照。 4.2.8 阴性对照：以不含目标微生物的样品，提取DNA，作为阴性对照。 4.3 仪器设备 4.3.1 恒温水浴锅：0℃~100℃。 4.3.2 涡旋振荡器。 4.3.3 离心机：15000g。 4.3.4移液器：单道20μL，50μL，100μL，1000μL；多道50μL~250μL。 4.3.5 ，电子天平，感量0.01g。 4.3.6 荧光光谱仪：配备96孔板及相应装置。 4.4 病原菌 4.4.1 操作步骤 4.4.1.1 样品制备、增菌培养和分离 见附录B。 4.4.1.2DNA提取 挑取可疑菌落，用DNA提取试剂盒进行提取，所得菌体DNA提取液作为样品待测液。 制备好的DNA样品应尽快进行检测。若暂时不能进行检测，应置于冰箱中一20℃保存，使用时置 于室温自然解冻，涡旋振荡混匀。 4.4.1.3DNA变性 取4.4.1.2中的样品待测液10μL分别加人6个1.5mL离心管，置于恒温水浴锅中，沸水浴中加热 3min，立刻转移到冰浴中，静置冷却。 4.4.1.4配制反应体系 4.4.1.4.1分别取病原菌分子马达探针溶液（见表A.1)2μL，用合成缓冲液（见表A.1)稀释到一定的倍 数。取稀释后的分子马达探针溶液10μL分别加人4.4.1.3的各离心管中。 4.4.1.4.2向4.4.1.4.1的各离心管中加人30μL启动缓冲液（二磷酸腺苷ADP和合成缓冲液按体积比 1：3混合配制），涡旋振荡混匀，立即离心去除管盖内壁上的水珠，放人37℃恒温摇床中温育30min。 取出离心管后分别加入450μL1XPBS缓冲液（见表A.1），涡旋振荡混匀，形成最终反应体系。 4.4.1.5加样与测定 用无菌水代替样品待测液，其他步骤不变制备空白对照。用无菌水代替样品待测液，不加人分子马 2 SAG GB/T38488—2021 别加人30uL荧光素酶溶液（1umol/L），用移液器混匀各孔溶液。荧光光谱仪设定激发波长为 496nm，发射波长为519nm，测定各孔荧光度值（OD值），用最终反应体系荧光度值减去本底荧光度值 和空白对照荧光度值即为样品的实际荧光度值。 4.4.2结果及判定 4.4.2.1结果计算 荧光差值按式（1)计算： AF= :(1) B-Bo 式中： △F 荧光差值； B 样品荧光度值； B。 空白对照荧光度值； SAG 4.4.2.2结果分析 将样品荧光度值绝对值与H,O的空白对照荧光度值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著 （p<0.05）则表示检出该基因。 4.4.2.3 结果判定 两次样品荧光差值平均值大于10%，则结果判定为阳性：两次样品荧光差值平均值小于或等于 10%，则结果判定为阴性。本方法判定为阳性结果的样品，宜参照附录B中的方法或相关国际权威微 生物经典检验方法进行阳性结果确证。 4.5病毒 4.5.1操作步骤 4.5.1.1提取 见附录B。 4.5.1.2 RNA提取 向4.5.1.1的沉淀中加人6mol/L的异硫氰酸胍溶液1mL，涡旋振荡使沉淀充分溶解，使用试剂盒 能进行检测，应置于一80℃保存备用。 4.5.1.3RNA变性 取4.5.1.2中的样品待测液10μL加人1.5mL离心管，置于恒温水浴锅中95℃水浴5min，立即转 移至50℃水浴静置1min。 4.5.1.4配制反应体系 取病毒分子马达探针溶液（见表A.1)2L，其他操作步骤同4.4.1.4。 4.5.1.5加样与测定 3