ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T36190—2018 草鱼出血病诊断规程 Protocol of diagnostic methods for hemorrhagic disease of grass carp 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36190—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：浙江省淡水水产研究所、中国检验检疫科学研究院、深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：沈锦玉、潘晓艺、郝贵杰、徐洋、江育林、陈爱平、高隆英、袁雪梅、尹文林、 姚嘉赞、蔺凌云。 1 GB/T36190—2018 草鱼出血病诊断规程 1范围 本标准规定了草鱼出血病诊断的临床症状、采样、病毒分离和鉴定以及综合判定。 本标准适用于草鱼出血病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 SC/T7016.3鱼类细胞系第3部分：草鱼卵巢细胞系（CO) SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AMV：鸟类成髓细胞性白血病病毒（avianmyeloblastosisvirus） bp：碱基对（basepair） cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementarydeoxyribonucleicacid) CO:草鱼卵巢细胞系（grass carp ovary cell line) CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate) dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸三钠（deoxyaguanosinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） EB：溴化乙啶（ethidiumbromide) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid) ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay） FBS:胎牛血清(fetal bovine serum) GCRV：草鱼呼肠孤病毒（grasscarpreovirus） HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸［4-（2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid] HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase） MCP：主要衣壳蛋白（majorcapsidprotein） PBST：磷酸盐吐温缓冲液（phosphatebuffersolution-tween-20） RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction） 1 GB/T36190—2018 RNA：核糖核酸（ribonucleicacid） SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamidegele- lectrophoresis) TBE：三羟甲基氨基甲烷硼酸乙二胺四乙酸缓冲液（Tris-Borate-EDTA） 4试剂和材料 4.1琼脂糖：电泳级。 4.2邻苯二胺：分析纯。 4.3 3AMV逆转录酶：10U/uL，一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.4RNA酶抑制剂（RNaseInhibitor）：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.5dNTP:含dCTP、dGTP、dATPdTTP各10mmol/L，一20℃保存。 4.6 5Tag酶：10U/μL，保存温度为一20℃，同时应避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.7无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 4.8 门 DNA分子量标准：DNAMarker2000，4℃保存。 4.9辣根过氧化物酶（HRP)标记的抗鼠抗体：一20℃保存。 4.10过氧化氢：分析纯、 (GCRV II 型)。 注：由农业部相关部门指定机构提供。 4.12羊抗GCRV免疫球蛋白：-20℃保存。 注：由动物防疫管理部门指定单位提供， 4.13鼠抗GCRV单克隆抗体：一20℃保存。 注：由动物防疫管理部门指定单位提供。 4.14 鱼类细胞系：CO应符合SC/T7016.3的规定。 4.15水：GB/T6682中一级水，核酸抽提和RT-PCR须使用无RNA酶的去离子水 4.16 鱼类细胞培养液：用含厄尔平衡盐（Earle'sbalancedsalts）的M199培养基配制（见附录A中 A.1)，或其他商品化的细胞培养基，另加10%胎牛血清（FBS)。 4.17鱼类细胞维持液：用含厄尔平衡盐（Earle'sbalancedsalts)的M199培养基配制，另加2%胎牛血 清(FBS)。 4.18 细胞消化液：见A.2。 4.19 AMV逆转录酶缓冲液和Taq酶缓冲液：分别见A.6、A.7。 4.20 电泳缓冲液：TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液，见A.8）。 4.21 MgCl2：25mmol/L，保存温度为一20℃。 4.22 包被稀释液：为0.05mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液（见A.11）。 4.23 封闭液：1%明胶（用包被稀释液配制）。 4.24 终止液：2mol/L的硫酸 4.25依据GCRVI型中S10片段序列设计引物，扩增S10中的698bp片段（见附录B中B.1)： 10 μmol/L正向引物:5'-CCCCG-ATCAT-CACCA-CGAT-3'; 10 μmol/L 反向引物:5'-CGCGT-TCGCT-GATGA-AAGG-3'。 4.26依据GCRVII型的M6片段序列设计引物，扩增M6中的320bp片段（见B.2）： 10 μmol/L正向引物:5'-AGTTC-TCAAA-GCTGA-GACAG-3'; 10μmol/L反向引物:5'-ACGTG-CGATT-GGAAG-AGCTT-3’。 2 GB/T 36190—2018 4.27依据GCRVIII型的L2片段序列设计引物，扩增L2中的474bp片段（见B.3）： 10 μmol/L 正向引物:5'-GTAAG-CCCAC-AGGTC-CCACT-3'; 10 μmol/L 反向引物:5'-AGATG-ACCCA-AGGAA-TAGCA-GT-3'。 5 器材和设备 5.11 倒置显微镜。 5.2生化培养箱。 5.3 普通冰箱和超低温冰箱。 5.4 组织研磨器。 5.5 冷冻离心机。 5.6 生物安全柜或超净工作台。 5.7 PCR 仪。 5.8 电泳仪、水平电泳槽和垂直电泳槽。 5.9 微量移液器。 5.10 凝胶成像仪或紫外透射仪。 5.11 高压灭菌锅。 5.12 微波炉。 5.13 水浴锅。 5.14 制冰机。 5.15 磁力搅拌器。 5.16 过滤系统。 5.17 酶标仪和洗板机。 6 临床症状 病鱼眼球突出、体色发黑，口腔、鳃盖和鳍条基部出血。撕开表皮，可见肌肉出现点状或块状出血。 剖检腹腔，可见肠道充血，肝、脾充血或因失血而发白。根据出血部位可将此病分为“红肌肉”“红肠子” “红鳍红鳃盖”三类。病鱼可以有其中一种或几种临床症状。 7 采样 7.1采样对象 草鱼、青鱼等易感鱼类。 7.2 2采样数量 采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3 样品采集 按GB/T18088的规定执行，体长≤4cm的鱼去尾后取整条（尾）鱼；体长为4cm～6cm（含）的鱼 取脑、内脏（包括肾）；体长>6cm的鱼则取脑、肝、肾和脾 3