ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22260—2008 饲料中甲基睾丸酮的测定 高效液相色谱串联质谱法 Determination of methyltestosterone in feeds- High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2008-08-01发布 2008-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22260—2008 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京）。 本标准主要起草人：赵根龙、苏晓鸥、苏淑清、孙志文、索德成 GB/T22260—2008 饲料中甲基睾丸酮的测定 高效液相色谱串联质谱法 1范围 本标准规定了以高效液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS)测定饲料中甲基睾丸酮含量的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中甲基睾丸酮的测定，配合饲料、浓缩饲料、 添加剂预混合饲料的定量限为10ug/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 饲料样品中的甲基睾丸酮以甲醇溶液超声提取，提取液离心后经C18固相萃取柱净化，以甲醇洗 脱，用高效液相色谱串联质谱仪、电喷雾正离子方式进行测定。 4试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682一级用水的 规定。 4.1甲醇：色谱纯。 4.3甲醇溶液Ⅱ：分别用量筒量取200mL甲醇（4.1）和800mL水，混匀。 4.4甲基睾丸酮标准品：纯度97%~103%。 4.5甲基睾丸酮标准溶液 4.5.1甲基睾丸酮标准储备液：准确称取甲基睾丸酮标准品（4.4)0.0500g，置于50mL容量瓶中，用 甲醇（4.1）溶解并定容至刻度，摇匀，其浓度为1mg/mL，贮于4℃～6℃冰箱中，有效期三个月。 4.5.2甲基睾丸酮标准工作液：准确吸取甲基罩丸酮标准储备液（4.5.1)5.00mL.置于50mL容量瓶 中，用甲醇（4.1）溶解并定容至刻度，摇匀，其浓度为100μg/mL。再以此稀释液配置10μg/mL、 1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL的标准工作液。有效期一个月。 4.6Ci固相萃取柱：载体60mg；承载液体积3mL。 5仪器 5.1实验室常用仪器、设备。 5.2分析天平：感量为0.0001g和0.001g各一台。 5.3超声水浴。 5.4离心机：4000r/min~5000r/min。 SAC 1 GB/T22260—2008 5.5 固相萃取装置。 5.6配备电喷雾离子源（ESI)的液相色谱串联质谱仪。 5.7可控温30℃~50℃氮吹装置。 6试样制备 按照GB/T20195制备样品，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存， 备用。 7 分析步骤 7.1提取 称取饲料样品5g（准确至0.001g），置于100mL离心管中，准确加人提取溶剂（4.2)50.00mL，加塞 充分摇动1min，再置超声水浴中超声提取20min，其间充分摇动两次。取出后于离心机上5000r/min离 心10min。 7.2净化 分别用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱（4.6）准确移取5mL离心液（7.1)分次上柱，控制过 柱速度在1mL/min以内。再用3mL水和3mL甲醇溶液（4.3）洗涤固相萃取柱，抽近干后用甲醇 （4.1)2mL洗脱。在氮吹装置（5.7）上40℃下用氮气吹干。准确加入2mL甲醇（4.1），涡旋振荡 1min，过0.45μm滤膜，上机测定。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：Cs柱，柱长150mm，柱内径2.1mm，粒度3.5μm或性能类似的分析柱。 柱温：室温。 流动相组成：甲醇十0.1%乙酸溶液=80十20（V+V2）。 流动相流速：300μL/min。 进样量：20μL。 7.3.2质谱条件 电喷雾离子源（ESI)正离子方式检测。 喷雾电压：5000V。 壳气流速：0.26L/min。 辅助气流速：6.9L/min。 毛细管温度：310℃。 母离子303，二级子离子为285、267。 碰撞能量见表1。 表1 甲基睾丸酮母离子及子离子碰撞能量表 母离子 子离子 碰撞能量/eV 303 285 23 303 267 22 其相对丰度比见表2。 表2甲基睾丸酮的子离子及相对丰度比 子离子(m/z) 285 267 相对丰度/% 100 95±19 2 GB/T22260—2008 7.3.3定性定量测定 取适量由7.2获得的样品制备液和相应浓度的甲基睾丸酮标准工作液（4.5.2）进行测定，以保留时 间和二级子离子m/z285、267进行定性。定性方法：试样保留时间与标准品的相对偏差不大于15%， 特征离子丰度与标准品相差不大于20%。定量方法：以二级子离子m/z285、267峰面积之和进行单点 或多点校正定量。 8结果计算与表述 8.1 结果计算 甲基睾丸酮在饲料中的质量分数X，以微克每千克（μg/kg）表示，可用式（1)计算： ..(1) m 式中： 选择性子离子色谱峰对应的甲基睾丸酮质量，单位为纳克（ng）； mi m—试样质量，单位为克(g)； n——稀释倍数。 8. 2 结果表示 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 重复性 3