ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22147—2008 饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑 特罗的测定 液相色谱质谱联用法 Determination of salbutamol, ractopamine and clenbuterol in feeds- Liquid chromatography-mass spectrometry 2008-06-27发布 2008-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 22147—2008 前言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人：张丽英、常碧影、贺平丽、董涛、杨文军、王宗义。 1 GB/T22147—2008 饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑 特罗的测定液相色谱质谱联用法 1范围 本标准规定了同步测定饲料中β-激动剂沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的液相色谱质谱联 用法（LC-MS）法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的 测定。本标准中沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗的检测限均为0.01mg/kg，定量限均为 0. 05 mg/kg. 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T14699.1饲料采样 3原理 试样经磷酸甲醇溶液提取，用固相萃取柱净化后，经反相C18柱梯度洗脱分离，采用质谱检测器以 三种物质的质量色谱峰保留时间和特征离子定性、确证，并用外标法定量。 4试剂和溶液 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯。水符合GB/T6682二级用水规定。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇。 4.4冰乙酸溶液（2%）：10mL冰乙酸用水稀释至500mL 4.5硫化钠溶液（1g/L）：称取0.250g硫化钠（NazS·9HzO)用水溶解，并定容至250mL。 4.6SPE小柱淋洗液与洗脱液 4.6.1淋洗液：移取9mL浓盐酸于1000mL水中，摇匀。 4.6.2洗脱液：移取10mL25%的氨水于100mL容量瓶中，用甲醇定容。 4.7流动相 A液：甲酸铵3.65g溶于500mL去离子水中，用甲酸调pH至3.80。 B液：乙腈，色谱纯。 4.8沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗标准溶液 4.8.1标准贮备液：称取沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗（标准品含量均>98%）各50mg分别 于50mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。于冰箱中4℃保存，保存期一个月。 4.8.2标准工作中间液：移取沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗标准贮备液（4.8.1)各1mL于 100mL容量瓶中，用冰乙酸溶液（4.4）定容。 1 GB/T22147—2008 4.8.3标准工作液：移取沙丁胺醇、莱克多巴胺和盐酸克仑特罗标准工作中间液（4.8.2）各0.5，1，5， 10mL于100mL容量瓶中，用冰乙酸溶液（4.4)定容 5仪器和设备 5.1 分析天平：感量0.0001g。 5.2聚丙烯离心管：50mL。 5.3恒温水浴：可保持水温至55℃和75℃。 5.4 涡旋混合器。 5.5 酸度计：准确至0.001。 5.6离心机。 5.7 混合型阳离子交换SPE小柱。 5.8[ 固相萃取（SPE)减压净化系统。 5. 9 液相色谱/质谱联用仪。 6 试样制备 按照GB/T14699.1规定方法采样，米取样品量至少500g，以四分法缩减至200g，粉碎过40目 筛，充分混匀，装瓶，备用。 7测定 7.1试样前处理 7.1.1试样提取 准确称取适量试样（配合饲料5g，浓缩饲料2g，添加剂预混合饲料1g，准确至0.0001g）于 50mL离心管，用磷酸甲醇提取液（4.3）40mL，振摇提取30min，然后于离心机上以3000r/min离心 10min。上清液倒人100mL容量瓶，残渣再用上述提取液（4.3）40mL、20mL，重复提取2次，每次振 摇5min～10min，于离心机上以3000r/min离心10min后，合并上清液于100mL容量瓶中。最后用 提取液（4.3）定容，混匀，过滤。 7.1.2净化 7.1.2.1配合饲料和浓缩饲料：吸取一定体积试样提取液滤液（配合饲料1mL，浓缩饲料0.5mL）于 5mL试管中，置55℃水浴中以氮气吹至近干。同时将固相萃取柱（5.7)固定于SPE减压净化系统 (5.8）上，依次用1mL甲醇和1mL水活化、平衡。向试管中加人冰乙酸溶液（4.4）1mL，涡旋振荡，然 后全部加到小柱上，控制过柱速度不超过的1mL/min，分别用1mL淋洗液（4.6.1）和1mL甲醇淋洗 一次，最后用1mL洗脱液（4.6.2）洗脱，洗脱速度不超过1mL/min。洗脱液于55℃水浴中，用氮气吹 干，准确加人1.00mL冰乙酸溶液（4.4)充分溶解混匀，并转移到上机样品瓶中，盖好，备用。 7.1.2.2添加剂预混合饲料：取提取液0.2mL，加硫化钠溶液（4.5)0.1mL，涡旋振荡，然后加入冰乙 酸（4.4)4mL，涡旋振荡，于离心机上以3000r/min离心10min，再取1mL上清液按照7.1.2.1步骤 过固相萃取柱（5.7)净化。 7.2测定 7.2.1色谱条件 色谱柱：Cls柱，内径2.1mm，柱长150mm，填充物粒度3μm。 柱温：室温。 流动相：流动相A：甲酸铵缓冲溶液（4.7），流动相B：乙睛（4.1）。 梯度洗脱程序见表1。 2 GB/T22147—2008 表1# 梯度洗脱程序 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0 98 2 5 70 08 50 50 每次进样间隔用流动相A+B=98+十2，平衡10min。 流速：0.20mL/min。 进样体积：20μL。 7.2.2质谱条件 采用电喷雾正离子（ESI十）模式做选择离子检测，选择离子为： 沙丁胺醇：m/z240,m/z222,m/z166； 莱克多巴胺m/z302，m/z284,m/z164； 盐酸克仑特罗：m/z277，m/z259，m/z203。 源温度：120℃。 取样锥孔电压：25V。 萃取锥孔电压：5V。 脱溶剂氮气温度：300℃。 脱溶剂氮气流速：300L/h。 7.2.3定性定量方法 7.2.3.1定性 通过样品总离子流色谱图上沙丁胺醇（m/z240，m/z222，m/z166）、莱克多巴胺（mz302，m/z284， m/z164）和盐酸克仑特罗（m/z277，m/z259，m/z203）的保留时间和各色谱峰对应的特征离子，与标准 品相应的保留时间和各色谱峰对应的特征离子进行对照定性。样品与标准品保留时间的相对偏差不大 于0.5%。每种药物的3个特征离子基峰百分数与标准品允许差分别为：当基峰百分数>50%时，允许 基峰百分数≤10%时，允许差土50%。 7.2.3.2定量 采用M十1的准分子离子的色谱峰面积做单点校正定量。 8结果的计算与表述 试样中药物含量（X）以质量分数计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算： X= A. XnXc. ...(1) AXm 式中： A.——待测试样测得的特征离子色谱峰面积； A。——标准溶液药物的特征离子色谱峰面积； m——试样质量，单位为克（g）； n——稀释倍数；