ICS 11.220 B 41 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 21674—2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 Detecting porcine circovirus with polymerase chain reaction 2008-04-09发布 2008-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21674—2008 前言 本标准附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊 GB/T 21674—2008 引言 猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒I型（porcine circovirus typel， PCV-1）和有致病性的猪圆环病毒IⅡ型（porcinecircovirustype2,PCV-2）。PCV-2是引发仔猪断奶后多 系统衰弱综合征（post-weaningmultisystemwastingsyndrome，PMWS）的主要病原。该病主要以患畜 生长迟缓、进行性消瘦和多系统病理损伤为特征，给世界各国主要养猪地区的规模化养猪业造成了一定 的经济损失。 GB/T21674—2008 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 1范围 本标准规定了猪圆环病毒（PCV）聚合酶链反应（PCR）检测方法的技术要求。 本标准适用于猪血清和组织中的猪圆环病毒检测，以及其I型(PCV-1)和IⅡI型（PCV-2)的鉴别。 2 实验室生物安全要求 试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2级）以上的实验室进行。 3实验材料、仪器设备和试剂 3.1实验材料 眼科剪、眼科镊、称量纸、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、 500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10μl、200μL、1000μL）、灭菌双蒸水。 3.2仪器设备 分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析 仪）、液氮罐或一70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、一20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL、 20 μL,200 μL,1 000 μL)。 3.3试剂 本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。 3.3.1消化液（见第A.1章）。 3.3.22%蛋白酶K溶液（见第A.2章）。 3.3.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第A.3章）。 3.3.4 2.5mmol/LdNTP（见第A.4章）。 3. 3. 5 10pmol/μLPCV引物（见第A.5章）。 3.3.6 0.5U/μLTaqDNA聚合酶（见第A.6章）。 3.3.710倍PCR缓冲液（见第A.7章）。 3.3.8 溴化乙锭（EB)溶液（见第A.8章）。 3. 3. 9 电泳缓冲液（50倍）（见第A，9章）。 3.3. 10 1%琼脂糖凝胶（见第A.10章）。 3. 3. 11 上样缓冲液（见第A.11章）。 3.3. 12 异丙醇。 3.3.13 75%乙醇（见第A.12章）。 3.3.14 15mmoL/L氯化镁（见第A.13章）。 3.3.15 灭菌双蒸水（见第A.14章）。 3.3.16 6电泳缓冲液（1倍）（见第A.15章）。 4操作程序 4.1样品的采集与处理 4.1.1样品的采集：濒死猪、扑杀的成年猪和流产胎儿取肺脏和淋巴结；幼龄猪取心脏；待检活猪，用 注射器取血 2 mL～4 mL,立即送往实验室。 1 GB/T21674—2008 4.1.2样品的处理：每份样品分别处理 4.1.2.1组织样品处理：取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨，加人2mL消化液（3.3.1)继续 研磨。取已研磨好的待检病料上清100μL，置1.5mL灭菌离心管中，再加入500μL消化液（3.3.1)和 10μL2%蛋白酶K溶液（3.3.2），混匀后，置55℃水浴中4h～16h。 置1.5mL灭菌离心管中，加人500μL消化液（3.3.1）和10μL2%蛋白酶K溶液（3.3.2），混匀，置 55℃水浴中4h~16h。 4.1.2.3阳性对照处理：分别取PCV-1和PCV-2细胞培养液各100μL，置1.5mL灭菌离心管中，每 管加人500μL消化液（3.3.1)和10μL2%蛋白酶K溶液（3.3.2），混匀，置55℃水浴中4h~16h。 4.1.2.4阴性对照处理：取灭菌双蒸水100μL，置1.5mL灭菌离心管中，加人500uL消化液（3.3.1) 10μL2%蛋白酶K溶液（3.3.2），混匀，置55℃水浴中4h16h。 4.2DNA模板的提取 4.2.1取出已处理的待检样品及阴性、阳性对照样品，每管加人600μL酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 （3.3.3），用力颠倒10次混匀，13000g离心10min。 4.2.2取上清500uL置1.5mL灭菌离心管中，加人等体积异丙醇（3.3.12），混匀，置液氮中3min或 70℃冰箱中30min。取出离心管，室温融化，4℃20000g离心15min。 4.2.3弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴人1mL一20℃预冷的75%乙醇（3.3.13）溶液，轻轻旋 转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，真空抽干15min。 4.2.4取出离心管，用50μL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。 4.3PCR扩增 每管取灭菌双蒸水8μL，2.5mmol/LdNTP(3.3.4）、10pmol/μLPCV引物（3.3.5）、15mmol/L 氯化镁（3.3.14）、10倍PCR缓冲液（3.3.7)、0.5U/μLTaqDNA聚合酶（3.3.6)各2μL,DNA模板 2μL，混匀，作好标记，加入矿物油约20μL，覆盖（有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油）。扩增 条件为94℃30s、62℃45s、72℃45s，35个循环后，72℃延伸10min。 4.4电泳 将PCR扩增产物15μL与3μL上样缓冲液（3.3.11)混合，点样于1%琼脂糖凝胶（3.3.10)孔中， 琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入1oobpLadderMarker（分子质量标准物），以5V/cm电压电泳40min， 紫外凝胶成像仪下观察结果。 5结果判定 当PCV-1阳性对照出现652bp扩增带，PCV-2阳性对照出现1154bp扩增带，阴性对照未出现 目的带时，实验结果成立。被检样品出现652bp扩增带为PCV-1阳性，出现1154bp扩增带为PCV-2 阳性，未出现相应扩增带的样品判为阴性。 2