ICS 65.120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 21108—2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 Determination of choramphenicol in feeds- High performance liquid chromatography tandem mass spectometry 2007-10-24发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21108—2007 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心 (北京）。 本标准主要起草人：赵根龙、高牛、宋荣、张发旺 本标准首次发布。 GB/T21108—2007 饲料中氯霉素的测定 高效液相色谱串联质谱法 1范围 本标准规定了测定饲料中氯霉素的高效液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）。 本标准适用于配合饲料和预混合饲料中氯霉素的测定，其最低定量限为10ug/kg，最低检测浓度 为5 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) 3原理 饲料中的氯霉素用乙酸乙酯提取，取部分提取液用氮气吹干。残渣溶于甲醇氯化钠溶液，用正已烷 萃取除去脂溶性杂质。再将氯霉素回提至乙酸乙酯，吹干。用乙腈水溶液溶解，过C1s小柱净化。最后 用LC/MS/MS法分离、检测和定量。 4试剂与材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T6682的一级用水的规定。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙酸乙酯。 4.4正已烷。 4.5 三氯甲烷。 4.6 乙睛溶液 4.6.1乙睛溶液I：取5.0mL乙腈加水95mL。 4.6.2乙腈溶液I：吸取乙睛50mL加水50mL。 4.7氯化钠。 4.8氯化钠溶液：浓度为40g/L,称取40.0g氯化钠（4.7)加水溶解定容到1000mL。 4.10氯霉素标准品：纯度大于98%。 4.11氯霉素标准液 4.11.1标准贮备液：准确称取100mg士0.1mg氯霉素标准品（4.10）用乙睛溶解，定容到100mL，该 溶液氯霉素浓度为1mg/mL，密封贮于冰箱内，有效期为一年。 4.11.2标准中间液I：吸取标准贮备液（4.11.1)5.00mL，于50mL容量瓶内，用乙睛溶液Ⅱ（4.6.2） 1 GB/T211082007 （4.6.2)定容至100mL,该溶液氯霉素浓度为1.0μg/mL,密封于冰箱内，有效期为3个月。 4.11.4标准中间液Ⅲ：吸取标准中间液Ⅱ（4.11.3)10.00mL于100mL容量瓶内，用乙睛溶液IⅡI （4.6.2)定容至100mL。该溶液氯霉素浓度为100ng/mL，密封贮于冰箱内，有效期为7天。 4.11.5标准工作溶液：用移液管分别吸取标准中间液Ⅲ（4.11.4)1、5、10、50mL于4个100mL容量 瓶内，用乙睛溶液Ⅱ（4.6.2）定容至刻度。该溶液氯霉素浓度为1.0、5.0、10、50ng/mL 4.12Cis固相萃取（SPE）小柱：载体200mg、承载液体体积3mL。 5仪器 5.1离心机：转速为4000r/min以上。 5.2超声波提取器。 5.3涡旋混合器。 5.5液相色谱串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI)的液相色谱串联质谱仪。 6试样的制备 筛，混合均匀，装入磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取一定量的试样（配合饲料5g，预混合饲料1g，精确至0.001g），置于50mL塑料离心管内 （5.4）加40.0mL乙酸乙酯（4.3）盖好密封盖于涡旋混合器上混合2min。放入超声波提取器中提取 取上清液20mL，于50℃加热器上用氮气吹至近干，待净化。 7.2净化 7.2.1液-液分配净化 用氯化钠甲醇溶液（4.9)2、1、1mL分三次溶解残渣（7.1）,均转移到同一个10mL具塞试管内。 加4mL正已烷，涡旋混合2min，放人离心机于4000r/min离心4min，弃去上层正已烷，重复上述操 作一次。水相加乙酸乙酯（4.3）3ml，涡旋混合2min，放入离心机4000r/min离心4min。吸取上层 乙酸乙酯，水相置另一个5mL具塞试管内，加乙酸乙酯（4.3)2mL重复上述操作一次。吸取上层乙酸 乙酯，置于上述同一个水相具塞试管内，置加热器上50℃下，用氮气吹干。用3mL乙睛溶液I（4.6.1） 溶解，待SPE小柱净化。 7.2.2SPE柱净化 每一试样各准备一支C1s小柱（4.12），顺序用5mL甲醇，5mL三氯甲烷，5ml甲醇和10mL水预 清洗C18柱。将样液（7.2.1）过此小柱（流速<1mL/min），用5mL乙睛溶液I（4.6.1）淋洗，最后用 3mL乙睛溶液Il（4.6.2）洗脱，收集洗脱液于10mL具塞试管内。洗脱液加5mL乙酸乙酯涡旋混合 1min，2000r/min离心，下层水相用乙酸乙酯重复萃取一次，合并乙酸乙酯提取液于5mL具塞试管 内。在加热器上（50℃）用氮气吹干，用2mL乙睛溶液Ⅱ（4.6.2）溶解，调节试样溶液浓度，使上机浓度 不高于100ng/mL。 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱：Cis柱，柱长150mm，柱内径2.1mm，粒度3.5um或性能类似的分析柱。 2 GB/T 21108—2007 柱温：室温。 流动相组成：乙腈十水=30+70（Vi+V2）。 流动相流速：250L/min。 进样量：10μL。 7.3.2质谱条件 电喷雾离子源（ESI)负离子方式检测。 喷雾电压：3500V。 壳气流速：0.68L/min。 辅助气流速：3.6L/min。 毛细管温度：300℃。 母离子321，二级子离子为257、152、121。碰撞电压如表1： 表1氯霉素的子离子及其碰撞电压 母离子 子离子 碰撞压力/eV 321 257 23 321 152 18 321 121 12 7.3.3试样的测定 离子（m/z)257、152、121进行定性，其相对丰度比见表2。以152作为定量子离子，并用氯霉素标准工 作液做单点或多点校准，以峰面积比较进行定量计算。 表2氯霉素的子离子及相对丰度比 子离子(m/z) 257 152 121 相对丰度/% 100 90±18 8±4 8结果计算与表述 8.1结果计算 试样中氯霉素的含量X，以质量分数微克每千克（μg/kg）表示，单点校准时可用式（1)计算： P, XVi XcXV,Xn ..(1) PXmXV3 式中： 试样溶液对应的色谱峰面积响应值； Vi 加人定容液的体积，单位为毫升（mL）； 氯霉素标准溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V2 氯霉素标准溶液的进样体积，单位为微升（μL)； 稀释倍数； n P1 氯霉素标准溶液对应的色谱峰面积响应值； 试样质量，单位为克（g）； m Va 试样溶液的进样体积，单位为微升（μL）。 多点校准时可用式（2)计算： ·(2 ) m XVs 3