ICS 65. 120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21102—2007 动物源性饲料中兔源性成分定性 检测方法 实时荧光PCR方法 Identification of rabbit derived materials in animal-originated feedstuffs- Real time PCR method 2008-04-01实施 2007-10-24发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21102—2007 前言 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、宝生物工程（大连）有限公司、中国 检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫 局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑秋月、李晶泉、干玉萍、徐昊、曹际娟、干爱丽、张舒亚、陈颖、徐宝梁、高宏伟、 宗卉、金东权。 本标准首次发布。 GB/T21102—2007 动物源性饲料中兔源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法 1范围 本标准规定了动物源性饲料中免源性成分实时荧光PCR检测方法，该检测方法的检出限为 0.1%。 本标准适用于动物源性饲料中免源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 实时荧光PCR realtimePCR 实时荧光聚合链式反应。 3.2 Ct 值 cycle time 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4原理 采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚单位I（cytochromeC oxidasesubunitI，COXI)基因上动物种间多态性的差异而进行兔源性成分鉴定。利用裂解液破碎细 胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。本 标准应用多色荧光检测技术，采用多重PCR方法，将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光 PCR兔DNA检测试剂盒。对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管 内对免的COXI基因及内参照基因同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质6-羧基荧光素（6-car- boxyfluorescein，FAM）、5-六氯荧光素（5-hexachloro-fluorescein，HEX）的探针进行特异性杂交，两色荧 光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。观察实时荧 光PCR的增幅曲线，从而对饲料中免源性成分进行快速检测。 5试剂与材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求 5.1DNA提取用试剂 5.1.1三氯甲烷。 1 GB/T21102—2007 5. 1. 2 异戊醇。 5. 1. 3 异丙醇。 5.1.470%乙醇。 5. 1.5 裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/L Tris-HCl(pH 8.0)[Tris-:tris（hydroxymethyl）aminomethane,三（羟甲基）氨基甲烷」，0.7mol/L NaCl,0.01 mol/L EDTA（pH8.0)(ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)。 5. 1. 6 TE缓冲液（Tris-HCI、EDTA缓冲液）：10 mmol/L Tris-HCI（pH8.0),1mmol/LEDTA (pH8.0)。 5.2实时荧光PCR免DNA检测试剂盒 5.2.12X兔源性检测预混合液：含有ExTaqHS（终浓度1.25U/25μL）、dNTPs（终浓度各 0.4mmol/L）),Mg²+（终浓度3mmol/L)。 5.2.2兔源性检测引物混合液：含有扩增兔基因组DNA及内参照的引物（序列详见表1）、内参照 (aDNA）。各引物终浓度0.1μmol/L~1.0μmol/L。 表1免及内参照引物序列 名称 序列 兔5-引物 5'-TAATCGTCACCGCACATGCC-3' 兔3'-引物 5'-CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA-3 内参照5'-引物 5'-GGCTGATTGACCGGCAGATTA-3 内参照3-引物 5'-GCGGGTATAGGTTTTATTGATGGC-3' 5.2.3兔源性检测探针混合液：检测免基因组DNA的探针及检测内参照的探针（序列详见表2）。探 光探针的具体使用要求进行。 表2免及内参照探针序列 名称 序 免探针 5'(FAM)-ACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA-3'(Eclipse) 内参照探针 5'(HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGACGCT-3'(Eclipse) 5.2.4 阳性对照：用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照。 5.2.5 、双蒸水。 6 仪器设备 6. 1 实时荧光PCR检测系统。 6.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 电子天平：感量0.01g。 6.3 6.4离心机：离心力12000g。 6.5 微量移液器：0.5μL~10μL,10μL~100μL,10μL~200μL,100μL~1000μL。 6.6 实时荧光PCR反应管。 6.7 恒温水浴箱。 7 试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。 2 GB/T21102—2007 8检验步骤 8.1样品的总DNA提取 称取适量饲料（饲料粒度为100目称取50mg；60目称取100mg；20目称取200mg）于1.5mL离 心管中，加入600uL~800μL裂解液，65℃30min，每隔10min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸 取上清液至一新离心管中，加400uL三氯甲烷十异戊醇（24十1），充分混匀；12000r/min离心5min， 吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h～2h；12000r/min离心10min，弃 上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μLTE，溶解沉淀。 也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA。 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和 280nm处的吸光值A260和Az80。DNA的浓度按式（1)计算： c=AXNX50/1000 .....(1) 式中： c—DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μuL)； A——260nm处的吸光值； N—核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。 8.3实时荧光PCR检测 8.3.1反应体系的体积为25uL，2×兔源性检测预混合液加12.5μL，免源性检测引物混合液和兔源 性检测探针混合液各加1μl，样品DNA（1ng/μL100ng/μL)1μL，加双蒸水至25μl。 8.3.2在各实时荧光PCR反应管中加入上述试剂后，盖紧管，离心5s～10s。 8.3.3将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。 8.3.4实时荧光PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。一般的反应程序为： 95℃10s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环，在每次循环的退火时收集荧光。 8.3.5检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果 8.3.6检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含免源性成分的样品作阳性对照， 用已知不含免源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。 9结果判断与表述 9.1结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。 9.2结果判定 9.2.1对照结果 空白对照：无FAM荧光信号检出。有HEX荧光信号检出，Ct值应<35.0。 阴性对照：无FAM荧光信号检出。有HEX荧光信号检出，Ct值应<35.0。 阳性对照：有FAM和HEX荧光信号检出。且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值<28.0。 否则，实验视为无效。 9.2.2检测结果的判定 Ct值≤35为有效值，Ct值>35为无效值（详见表3）。