ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 21105—2007 动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法 PCR方法 Identification of Canis derived materials in animal-originated feedstuffs-PCR method 2007-10-24发布 2008-04-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T21105—2007 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、干岩、干立新、徐宝梁、陈颖、吴亚君、宗卉、温燕辉、曹际， 本标准首次发布。 1 GB/T21105—2007 动物源性饲料中狗源性成分定性 检测方法PCR方法 1范围 本标准规定了动物源性饲料中狗（Canis）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为 0.1%. 本标准适用于动物源性饲料中狗源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction;PCR 用于扩增位于两段已知序列之间DNA（deoxyribonucleosideaacid，脱氧核糖核酸）的方法。模板 别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（de- oxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火 和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个～30个扩增 循环，扩增倍数达到约10°。 4原理 利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行 5试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求 5.1狗源性成分检测用引物（对）序列为： canis F:5'-TCCAGGTAAACCCTTCTT-3' canis R:5'-TACGAGCAAGGGTTGATGG-3" 5.2TaqDNA聚合酶（Taq，Thermusaquaticu，水生栖热菌）。 5.3限制性内切酶:HphI酶。 5.4dNTPs：dATP(deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidinetriphos 1 GB/T21105—2007 phate，脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。 5.5琼脂糖：电泳纯。 5.6溴化乙锭。 5.7三氯甲烷。 5.8异丙醇。 5.970%乙醇。 5.10分子量标准品（100bp2000bp）（bp：basepair，碱基对）。 5.11裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/LTris- HCl(pH8.0)[Tris-:tris（hydroxymethyl)aminomethane,三（羟甲基）氨基甲烷],0.7mol/LNaCl, 0.0lmol/LEDTA（pH8.0)(ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)。 5.12TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）:10mmol/LTris-HCl（pH8.0)，1mmol/LEDTA (pH8. 0) . 5.1310XPCR缓冲液:100mmol/LKCl,160mmol/L(NH,),SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/L Tris-HCl（pH8，8），1%TritonX-1oo（t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇）， 1mg/mLBSA(bovineserumalbumin,牛血清蛋白）。 5.14电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL； 使用时10倍稀释。 5.15溴化乙锭贮存液：用水配制成10mg/mL。 5.16加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液。 5.17 酶切缓冲液:10mmol/L Tris-HCl (pH7.5),10mmol/LMgCl²,50mmol/LNaCl,0.1mg/mLBSA。 6仪器设备 6.1DNA热循环仪。 6. 2 2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.3恒温水浴锅。 6.4 离心机：离心力12000g。 6.5 微量移液器。 6.6电泳仪。 6.7 紫外检测仪。 6. 8 pH计。 6.9 天平：感量0.01g。 7试样选取与制备 按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用。 8检验步骤 8.1样品的总DNA提取 称取适量饲料（饲料粒度为100目称取50mg60目称取100mg；20目称取200mg）于1.5mL离 心管中，加人600μL～800μL裂解液，65℃30min，期间不时振荡混匀；12000g离心5min；转移上清 于洁净离心管中，加400μL三氯甲烷+异戊醇（24+1），混勾；12000g离心5min，取上清液；加0.8倍 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。 2 GB/T21105—2007 8.2DNA浓度和纯度的测定 取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1）计算： c=AXNX50/1000 ...(1) 式中： c——DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)； A—260nm处的吸光值； N——核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增。 8.3PCR扩增 25μL的反应体系，在0.2mL的PCR反应管中，引物canisF和canisR各200nmol/L,10×PCR （100ng士50ngDNA）。设立阳性对照、阴性对照、空白对照组。 PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般的反应程序为：94℃预变性3min。94℃变性45s，56℃ 退火45s72℃延伸45s，35个循环。72℃延伸5min。4℃保存。 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含狗源性成分的样品作阳性对照，用已 知不含狗源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。 8.4PCR扩增产物电泳检测 取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL， 制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL～8μLPCR扩增产物分别和适量 加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测仪下观察电 泳结果并记录。 8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测 如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应。 反应体系（20μL)：HphI酶2U，酶切缓冲液2μL，加PCR扩增产物至总体积20μL。 酶切在37℃下进行，20min。酶切完成后电泳，方法见8.4。 9结果判断与表述 9.1PCR扩增产物电泳检测结果 阳性样品的PCR扩增产物大小为213bp（序列参考附录A）。 9.2限制性内切酶酶切结果 阳性样品PCR产物采用内切酶HphI酶切后，酶切片段大小为179bp和34bp。 9.3结果表述 PCR产物为阴性者判为不含有狗源性成分，表述为未检出狗源性成分。 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行。 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。