ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T21036—2007 饲料中盐酸多巴胺的测定 高效液相色谱法 Determination of dopamine hydrochloride in feeds- High performance liquid chromatography 2007-09-01实施 2007-06-21发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21036—2007 前言 本标准是在查阅了国内外大量文献的基础上，根据我国技术发展水平研究制定的，采用了高效液相 色谱法检测饲料中盐酸多巴胺的含量。 本标准由农业部畜牧业司提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准负责起草单位：中国农业大学、农业部兽药安全监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：张素雷、沈建忠、丁双阳、程林丽、江海洋 GB/T21036—2007 饲料中盐酸多巴胺的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了测定饲料中盐酸多巴胺含量的高效液相色谱法。 为0.5mg/kg，最低定量限为1.7mg/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 3方法原理 用盐酸溶液/甲醇提取饲料中的盐酸多巴胺，经离心除去固体物及部分杂质后，用酸性氧化铝固相 萃取柱净化，洗脱液经滤膜过滤后用高效液相色谱荧光检测器检测 4试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合GB/T6682二级用水规定。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙酸乙酯：色谱纯。 4.3硫化钠溶液：浓度为325mg/L,称取0.1g硫化钠（NazS·9H,O)用水溶解，并定容至100mL。 4.4 盐酸溶液：浓度为0.1mol/L，取8.6mL浓盐酸于1L容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。 4.5 提取液：取50mL盐酸溶液（4.4）与450mL甲醇混匀。 4. 6 固相萃取柱活化液：称取4.5g氯化钠溶于90mL水中，再加入10mL甲醇混匀。 4.7 洗脱液：取450mL盐酸溶液（4.4）与50mL甲醇混匀。 4.8 酸性甲醇溶液：取250uL甲酸溶于500mL甲醇中，混匀。 4.90.02%甲酸溶液：取200μL甲酸溶于1000mL水中，混匀。 4.10盐酸多巴胺标准贮备液：准确称取盐酸多巴胺标准品（含量大于98%）0.1000g于100mL容量 瓶中，用酸性甲醇溶液（4.8）溶解定容，配制成浓度为1mg/mL的盐酸多巴胺贮备液。4℃条件下贮藏， 有效期三个月。 4.11盐酸多巴胺标准中间液：移取10mL标准贮备液（4.10）置于100mL容量瓶中，用酸性甲醇稀释 并定容，配制成浓度为100μg/mL的盐酸多巴胺标准中间液。4℃条件下贮藏，有效期一个月 4.12盐酸多巴胺标准工作液：分别移取盐酸多巴胺标准中间液（4.11）0.025mL、0.050mL、 0.125mL、0.250mL、1.25mL和2.50mL于25mL容量瓶中，用水稀释定容配制成0.1μg/mL、 0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL和10.0μg/mL标准工作液。 1 GB/T21036—2007 5仪器和设备 5.1实验室常用仪器、设备。 5.2高效液相色谱仪（配有荧光检测器）。 5.3分析天平。 5.4 旋涡混合器。 5.5 离心机。 5. 6 酸性氧化铝固相萃取柱500mg/根。 6试样制备 按GB/T14699.1规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减取约200g，经粉碎，全部过0.45mm 孔筛，混匀装人磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取一定量的试样（配合饲料2g，浓缩饲料1g，预混合饲料1g，准确至0.001g）置于50mL离心 管中，加人10mL试样提取液（4.5），涡动1min，3500r/min离心5min。将上清液转入另一个50ml 离心管中，再分别用5mL试样提取液重复提取两次，合并三次试样提取液。 7.2配合饲料和浓缩饲料的净化 提取后立即将试样提取液置4℃冰箱中冷却。将酸性氧化铝固相萃取柱用5mL固相萃取柱活化 液（4.6）活化。从4C冰箱中取出试样提取液，全部加于固相萃取柱上，自然流过小柱。用10mL乙酸 乙酯洗涤小柱，吹干。最后用20mL洗脱液（4.7）洗脱，保持流速不超过1mL/min，收集洗脱液，并尽 可能吹干小柱。洗脱液经0.45μm滤膜过滤后用高效液相色谱分析。 7.3预混合饲料的净化 立即向试样提取液中加入硫化钠溶液（4.3)2mL，涡动10s，3500r/min离心5min。上清液转移 至另一离心管中。固相萃取柱净化方法同7.2。 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱：Cis柱，长250mm，内径4.6mm，粒径5μum，或相当者。 柱温：室温。 流动相：0.02%甲酸溶液（4.9)与甲醇（4.1)进行梯度洗脱，梯度洗脱条件详见表1。 激发波长：290nm。 发射波长：330nm。 进样体积：10μL。 表1梯度洗脱条件 时间/ 流速/ 0.02%甲酸 甲醇/ min (mL/min) % % 0 0. 6 95 5 9 0.6 95 5 1 10 90 22 1 10 90 25 0. 6 95 5 30 0.6 95 5 2 GB/T21036—2007 7.4.2液相色谱测定 分别取适量的标准工作液和试样溶液，按7.4.1列出的条件进行液相色谱分析测定。以标准工作 液作单点或多点校准，并用色谱峰面积积分值定量。测定中应注意调整试样溶液的浓度，使盐酸多巴胺 的积分值落在标准曲线的相应范围内，并在试样溶液分析间适当穿插标准工作液，以确保定量的准确 性。所得盐酸多巴胺的色谱图见图1。 400. 00 350.00 00. 00 13A 250. 00 200.00 150. 00 100. 00 . 50. 00. 0. 00 2. 00 1. 00 6. 00 8. 00 10. 00 12. 00 11. 00 16. 00 18. 00 20. 00 22. 00 21. 00 26. 00 28. 00 30. 00 (mi1) 图15μg/mL标准溶液色谱图（保留时间3.5min） 8结果计算与表述 饲料中盐酸多巴胺的含量X，以质量分数（mg/kg）表示，按式（1)计算： cV.n (1) m 式中： 试样液中对应的盐酸多巴胺的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）； V试样液总体积，单位为毫升（mL）； n——稀释倍数； m一饲料样品质量，单位为克（g）。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 9精密度 同一实验室由同一操作人员使用同一台仪器完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于15%。