ICS 65.120 B 46 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 21033—2007 饲料中免疫球蛋白IgG的测定 高效液相色谱法 Determination of immunoglobulin in feeds- High-performance liquid chromatography 2007-09-01实施 2007-06-21发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21033—2007 前言 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：国家饲料质量监督检验中心（武汉）、武汉恩彼生物科技有限责任公司。 本标准主要起草人：刘小敏、周增太、何一帆、高利红、杨林 5z1 1 GB/T21033—2007 饲料中免疫球蛋白IgG的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中免疫球蛋白IgG含量的方法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、含IgG的饲料原料（包括血浆蛋白粉等）中免疫球蛋白IgG的 测定。最低检出限为5μg（取样1g，最低检出浓度为5mg/kg）。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 根据高效亲和色谱的原理，在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基连接，在pH2.5的盐酸 甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白IgG。 4试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水为去离子水或相当纯度的水，应符合 GB/T6682二级用水的规定。 4.1磷酸二氢钾。 4.2磷酸氢二钾。 4.3流动相A：pH6.5.0.05mol/L磷酸盐缓冲液 4.4流动相B：pH2.5,0.05mol/L甘氨酸盐酸缓冲液。 4.5IgG储备标准液： 称取IgG标准品（纯度≥95%)0.0100g，用流动相A（4.3）溶解并定容至10.0mL，摇匀，浓度为 1. 0 mg/mL 4.6IgG工作标准溶液： 临用时配制。 5仪器和设备 5.1实验室常用仪器设备。 5.2 pH计。 5.3超纯水装置。 5.4匀浆机。 1 GB/T21033—2007 5.5 高效液相色谱仪：具紫外检测器和梯度洗脱装置。 6试样制备 按GB/T14699.1采样，按GB/T20195选取饲料样品至少500g，四分法缩减至少100g，磨碎，通 过0.28mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。 7分析步骤 7.1试样处理 称取一定量试样（精确至0.0001g)（配合饲料、浓缩饲料称取试样2g~5g；血浆蛋白粉称取试样 0.1g；鸡蛋粉称取试样0.5g）于茄形瓶中，准确加人25.0mL流动相A（4.3）,用匀浆机匀浆5min，取 溶液10mL于离心管中，以1000g（3500r/min)离心10min。通过0.45um微孔滤膜后进样。 7.2测定 7.2.1HPLC测定参数的设定 色谱柱:Pharmacia HI-Trap Protein G柱,1 mL。 波长：280nm。 进样量：20μL。 7.2.2梯度洗脱条件 梯度洗脱条件见表1。 表1梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min） 流动相A/% 流动相B/% 0 0.5 100 0 4. 5 0. 5 100 5.5 0. 5 0 100 15.0 0.5 0 100 18.5 0.5 100 0 26.0 0.5 100 0 7.2.3测定 7.2.3.1先用5倍柱体积的重蒸馏水或去离子水洗柱，再用10倍柱体积流动相A（4.3)平衡柱，按洗 脱程序进行洗脱。 7.2.3.2分别取7.1试样处理液和4.6标准工作液进行测定。以色谱峰面积积分值做单点或多点校 准定量。 8结果计算 8.1试样中IgG含量w，以质量分数表示，数值以%表示，按式（1)计算： P XVXcXV.X100 (1) PstXmXV.X1000 式中： 一试样峰面积值； V一一试样体积，单位为毫升(mL)； 标准工作液（4.6）中IgG的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； Vst 标准工作液进样体积，单位为微升（μL）； Pst 标准工作液峰面积值； 称取试样的质量，单位为克（g）； m 2 GB/T21033—2007 V一一试样进样体积，单位为微升（μL）。 8.2平行测定结果用算术平均值表示，保留小数点后两位有效数字。 重复性 9 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值不得超过算术平均值的15%。