ICS 13.060.50 z 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T204662006 水中微囊藻毒素的测定 Determination of microcystins in water 2006-08-24发布 2007-01-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20466—2006 前言 本标准由中国科学院提出。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国科学院水生生物研究所。 本标准主要起草人：甘南琴、肖邦定、宋立荣、刘永定、陈伟 1 GB/T20466—2006 水中微囊藻毒素的测定 1范围 本标准规定了高效液相色谱法和间接竞争酶联免疫吸附法测定水中微囊藻毒素（环状七肽）的条件 和详细分析步骤。 本标准适用于饮用水、湖泊水、河水、地表水中微囊藻毒素的测定。 样品中微囊藻毒素的检出限：高效液相色谱法和酶联免疫吸附法均为0.1μg/L。 2微囊藻毒素的分子式、分子质量及结构式 2.1分子式 微囊藻毒素-RR（MC-RR）：C4HzsNi:O12，微囊藻毒素-YR（MC-YR）：C52Hz2N1oO13，微囊藻毒素 LR(MC-LR) : C4g H74N1o O12 2.2分子质量 MC-RR:1 038.2, MC-YR:1 044.0, MC-LR: 994.5。 2.3结构式 D-Glu LH: Mdha C2 ADDA 11.C OCH: H NH D-Ala OOH D-β-Me-Asp MC-RR、MC-YR、MC-LR中的R,和R²见表1。 表1MC-RR、MC-YR、MC-LR中的R,和R2 微囊藻毒素名称 Ri R2 MC-RR L-Arg L-Arg MC-YR L-Tyr L-Arg MC-LR L-Leu L-Arg 3高效液相色谱法 3.1方法提要 微囊藻毒素在波长238nm下有特异的吸收峰。不同的微囊藻毒素异构体在高效液相色谱中有不 同的保留时间，与标准微囊藻毒素的保留时间相比较，可确定样品中微囊藻毒素的组成。依据出峰面 积，计算水样中微囊藻毒素的含量。 3.2试剂和溶液 除非另有规定，仅使用分析纯试剂、蒸馏水或去离子水。 1 GB/T 20466—2006 3.2.1甲醇：色谱纯。 3.2.4磷酸二氢钾溶液（0.05mol/L）：称取0.68g磷酸二氢钾，用水溶解，定容至100mL。 3.2.520%（体积分数）磷酸溶液：20mL磷酸与80mL水混合。 3.2.6三氟乙酸（TFA):色谱纯。 3.2.7磷酸盐缓冲溶液：用20%（体积分数）磷酸溶液（3.2.5)将磷酸二氢钾溶液（3.2.4)调至pH3.0。 3.2.8淋洗溶液：10mL水；10mL20%（体积分数）甲醇溶液（3.2.2）。 3.2.9洗脱溶液（酸化甲醇溶液）：用甲醇（3.2.1)将0.1mL三氟乙酸（3.2.6）定容至100mL。 3.2.10微囊藻毒素标准品：微囊藻毒素-LR（MC-LR）、微囊藻毒素-RR（MC-RR）、微囊藻毒素-YR （MC-YR），纯度不低于95%。 3.2.11微囊藻毒素标准储备液：分别称取微囊藻毒素标准品（3.2.10)MC-LR、MC-RR、MC-YR各 0.5mg（按实际含量折算），用500μL甲醇（3.2.1)溶解，再用纯水定容至50mL，一20℃保存。此标准 储备溶液的浓度约为10μg/mL。 释至约0.00 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL(临 用时配制）。 SAC 3.3仪器和设备 3.3.1不锈钢筛：500目。 3.3.2不锈钢或玻璃杯式滤器：250mL。 3.3.3抽滤瓶：带真空泵。 3.3.4滤膜：GF/C玻璃纤维滤膜和0.45μum乙酸纤维酯滤膜。 3.3.5Cis固相萃取小柱：Sep-pak柱，500mg/6mL。 3.3.650mL玻璃注射器、100mL玻璃注射器或SPE固相萃取装置。 3.3.7旋转蒸发器或吹氮浓缩器。 3.3.8涡旋混合器。 3.3.9高效液相色谱仪：配有紫外可见光检测器。 3.3.10色谱柱：Cls反相柱，柱长250mm，内径4.6mm，填料粒经5μm。 3.4分析步骤 3.4.1水样的采集和保存 用采水器采集1500mL～2000mL水样（水样采集后，应在4h内完成以下前处理步骤）。用 500目的不锈钢筛（3.3.1)过滤，除去水样中大部分浮游生物和悬浮物。取过滤后的水样1200mL于 玻璃杯式滤器（3.3.2)中，依次经滤膜（3.3.4)减压过滤。准确量取1000mL滤液置于棕色试剂瓶中。 注：如减压过滤后的水样不能立即分析，可置于玻璃容器中，在一20℃保存，30d内分析完毕。 3.4.2水样的富集和洗脱 3.4.2.1C18固相萃取小柱（3.3.5)预活化 用玻璃注射器吸取10mL甲醇（3.2.1），注入C1.固相萃取小柱（自然滴下）。当甲醇液面接近小柱 上层筛片时，加人10mL～15mL纯水活化（活化过程，不应使Cis固相萃取小柱变干，萃取小柱中应始 终充满液体）。连接50mL或100mL玻璃注射器，或连接SPE固相萃取装置（3.3.6）。 3.4.2.2微囊藻毒素的富集和洗脱 将1000mL水样滤液（3.4.1)依次注人50mL玻璃注射器、100mL玻璃注射器或SPE固相萃取 装置（3.3.6）中，使水样滤液流经预先活化的C18固相萃取小柱（3.4.2.1）进行富集（控制流速为 8mL/min10mL/min）。富集完毕，依次用淋洗溶液（3.2.8）淋洗Cis固相萃取小柱。再用10mL洗 2 GB/T204662006 脱溶液（3.2.9)洗脱微囊藻毒素（萃取过程，不应使C1固相萃取小柱变干，萃取小柱中应始终充满液 体）。洗脱液收集在玻璃容器中。保留富集后的水样，用于再次富集。 3.4.2.3再次富集和洗脱 按3.4.2.2的操作步骤，再次富集、洗脱。 注：有条件的实验室可选择较大柱容量的C18固相萃取小柱，只需对水样富集、洗脱一次。 3.4.3定容 将两次洗脱液混合，在40℃下用旋转蒸发器或吹氮浓缩器（3.3.7）浓缩至干。用1mL甲醇 （3.2.1)分两次（第一次、第二次各0.5mL）溶解浓缩至干的物质，用涡旋混合器（3.3.8）充分涡旋混合 1min。用尖嘴吸管取出，小股氮气流吹干（或离心干燥），加50%（体积分数）甲醇溶液（3.2.3）定容至 100μL。此步骤均应在玻璃容器中操作。 3.4.4测定 3.4.4.1色谱条件 色谱柱温度：40℃； 流动相：甲醇（3.2.1)与磷酸盐缓冲溶液（3.2.7)按体积比（57：43)混合； 流速：1 mL/min; 检测器：紫外可见光检测器波长238nm。 3.4.4.2定量 用进样器分别吸取10μL标准系列溶液（3.2.12），注入高效液相色谱仪（3.3.9）。在上述色谱条件 （3.4.4.1)下测定标准系列溶液的响应峰面积。以响应峰面积为纵坐标，标准系列溶液的浓度为横坐 标，绘制标准曲线或计算回归方程。 吸取10μL试样（3.4.3)注入液相色谱仪，在上述色谱条件（3.4.4.1)下测定试样的响应峰面积（应 在仪器检测的线性范围内）。依据测定的响应峰面积，在标准曲线上查出（或用回归方程计算出）水样中 微囊藻毒素的含量。 在上述色谱条件（3.4.4.1）下,MC-RR、MC-YR、MC-LR的保留时间分别约为8.8min、9.5min、 10.6 min。 在上述色谱条件（3.4.4.1)下，标样及水样中微囊藻毒素的色谱图见图1和图2。 0. 014 R MC- 0. 012 Eo1o'0 0. 008 光度 9000 Et00'0 0. 002 0. 000 L. 2. 00 4. 00 6. 00 8. 00 10. 00 12. 00 min 图1微囊藻毒素（MC-RR、MC-YR、MC-LR）标样色谱图 3 SAC