ICS 65.120 B 20 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20190—2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法 Detection of bovine, sheep and goat-derived material in feeds- Qualitative polymerase chain reaction(PCR)method 2006-05-17发布 2006-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20190—2006 前言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。 本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（北京）、中国农业科学院农业资源与农业区划研 究所。 本标准主要起草人：杨曙明、宋荣、程宪国、高生、赖卫华、王彤 1 GB/T20190—2006 引言 含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用，一直被认为是疯牛病传播的主要途径，禁止疫区含牛羊源 性成分的动物源性饲料的生产、流通和使用，成为预防疯牛病感染、流行的主要手段之一。1996年欧盟 提出了动物源性饲料中牛羊源性成分的检测方法（EUR18096EN）。2002年我国发布了中国出入境检 检测动物源性饲料。 我国没有针对配合饲料和浓缩饲料等饲料产品中牛羊源性成分的检测标准，EUR18096EN和 SN/T1119一2002方法适用于动物源性饲料，在DNA提取上不适用于以植物为主要基质的配合饲料 和浓缩饲料。本方法是在SN/T1119一2002、欧盟方法的基础上提出，在大量实验数据基础上建立起 来的。 GB/T20190—2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应（PCR）法 1范围 本标准规定了PCR方法对饲料中牛羊源性成分定性检测。 本标准适用于饲料中牛羊源性成分的定性检测，本方法的最低检出限为0.25%。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 根据牛羊遗传物质的特异性，通过检索基因库或专利库，选择牛羊特异性的DNA序列，该序列必 须在同类动物（无论什么品种）中都具有高度保守性，而其他动物皆不含有。利用种属特异性的引物通 过PCR扩增这一特定的DNA序列，通过电泳分离PCR产物，以标准长度的PCR产物作对照，检测 PCR扩增出的这一特定的DNA片断，判断是否含有牛羊源性成分。此外，通过限制性内切酶酶切反 应，进一步判断结果。通过对PCR扩增的特定DNA片断进行测序，与标准序列进行比较，来确认检测 结果。 4试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求。 4.1三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl)溶液，1mol/L，pH值为8.0：在800mL去离子水中溶解 121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris），冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0,加水定容至1L，分 装后高压灭菌。 4.2三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCI)溶液，1mol/L，pH值为7.5：在80mL去离子水中溶解 12.11gTris，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至7.5加水定容至100mL，分装后高压灭菌。 4.3氯化钠溶液，5mol/L：在80mL水中溶解29.22g氯化钠，加水定容至100mL。 4.4乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA)溶液，500mmol/L：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA- Na2·2H,O）加入700mL水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠溶液调pH值至 8.0，用水定容到1L，分装后高压灭菌。 4.5漠代十六烧基三甲胺（CTAB）提取缓冲液I：在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠，摇动容 器使溶质完全溶解，然后加人50mLTris-HCI溶液（4.1）和20mLEDTA溶液（4.4），然后定容至1L， 分装后高压灭菌。 4.6溴代十六烷基三甲胺（CTAB)提取缓冲液Ⅱ：在800mL去离子水中加人46.75g氯化钠，20g溴 代十六烷基三甲胺（CTAB），摇动容器使溶质完全溶解，然后加人50mLTris-HCI溶液（4.1）和20mL EDTA溶液（4.4），用水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.7核糖核酸酶A(RNaseA)贮备液：将10mgRNaseA溶解于987μL水中，加人10μLTris-HCl GB/T20190—2006 溶液（4.2），加入3L氯化钠溶液（4.3），于100℃水浴中保温15min，冷却到室温后，分装成小份保存 于一20℃。 4.8Tris饱和苯酚和三氯甲烷混合液，V(Tris饱和苯酚）十V（三氯甲烷）=1十1。 4.9三氯甲烷和异戊醇混合液，V(三氯甲烷）十V异戊醇）=24十1。 4.10异丙醇。 4.11乙酸钠溶液，3mol/L：在80mL水中，加人40.81g三水合乙酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值 到5.2，用水定容到100mL，分装后高压灭菌。 4.12体积分数为75%的乙醇。 4. 13 3Tris-EDTA（TE)缓冲液，pH值为8.0：在800mL水中，依次加人10mLTris-HCI溶液（4.1)和 2mLEDTA溶液（4.4）,用水定容至1L，分装后高压灭菌。 4.14正已烷。 4.15TaqDNA聚合酶（5U/uL）及10XPCR反应缓冲液（含25mmol/LMg²+）。 4.16牛源性成分检测用引物（对）序列为： 5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3 5'-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3 4.17羊源性成分检测用引物（对）序列为： 5-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3 5'-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3' 4.18引物溶液：用TE缓冲液分别将上述引物稀释到25μmol/L 4.19各10mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP)混合溶液。 4.2010mg/mL溴化乙锭溶液。 注：溴化乙锭（EB）有致癌作用，使用时要戴一次性手套，使用后按安全规定处置。 4.21DNA分子量标记（50bp~300bp）。 4.22电泳缓冲液：称取54gTris,27.5g硼酸，20mLEDTA溶液（4.4），然后用水定容到1L，使用时 10倍稀释。 10mL水溶解；称取蔗糖50g，用30mL水溶解，合并三种溶液，用水定容至100mL，在4℃中保存。 4.24琼脂糖。 4.25 PCR产物回收纯化试剂盒：按使用说明操作。 4.26 限制性内切酶Sau3AI及反应缓冲液。 4. 27 凝胶回收纯化试剂盒：按使用说明操作。 4.28 石蜡油。 4.29 DNA测序试剂 4. 30 体积分数为95%的乙醇。 4.31甲酰胺。 5仪器 5.1 实验室常用仪器设备。 5.2PCR扩增仪。 5.3电泳仪。 5.4 凝胶成像仪或紫外透射仪。 5.5 DNA序列分析仪。 5.6高压灭菌锅。 2