ICS 67.120.30 B 50 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T203612006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法 Determination of malachite green and gentian violet residues in fishery products- High performance liquid chromatography with fluorescence detector 2006-06-21发布 2006-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20361—2006 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人.郑斌、赵红萍、冷凯良、刘十忠、干慧媚、耿雷、陈雪昌、蔡友琼、黄冬梅、钟志 冯敬宾。 GB/T20361—2006 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定 高效液相色谱荧光检测法 SAG 1范围 chitegreen，LMG）残留总量、结晶紫（Gentianviolet，GV）及其代谢物隐色结晶紫（Leucogentianviolet， LGV）残留总量的高效液相色谱荧光测定方法。 本标准适用于水产品可食部分中孔雀石绿和结晶紫残留的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3原理 样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐色孔雀石绿或隐色结晶 紫，乙睛-乙酸铵缓冲混合液提取，二氯甲烷液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检 测，外标法定量。 4试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682一级水的标准。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2二氯甲烷。 4.3 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm~0.150mm。 4.4二甘醇。 4.5 硼氢化钾。 4.6无水乙酸铵。 4.7 冰乙酸。 4.8氨水。 4.9 硼氢化钾溶液[0.03mol/L：称取0.405g硼氢化钾于烧杯中，加250mL水溶解，现配现用。 4. 10 硼氢化钾溶液L0.2mol/L1：称取0.54g硼氢化钟于烧杯中，加50mL水溶解，现配现用。 4.112 20%盐酸羟胺溶液：溶解12.5g盐酸羟胺在50mL水中。 4. 12 对-甲苯磺酸溶液[0.05mol/L]：称取0.95g对-甲苯磺酸，用水稀释至100mL。 4.13 乙酸铵缓冲溶液[0.1mol/L]：称取7.71g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，氨水调pH到10.0。 4. 14 乙酸铵缓冲溶液L0.125mol/L：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，冰乙酸调pH 到4.5。 4. 15 5酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL。使用前用5mL乙睛活化。 4. 16 5VarianPRS柱或相当者：500mg，3mL。使用前用5mL乙睛活化。 1 GB/T20361—2006 4.17标准品：孔雀石绿（MG）分子式为［（C23H25N）（C,HO）]2C,H,O4、结晶紫（GV）分子式为 C25HzgCIN3，纯度大于98%。 4.18标准储备溶液：准确称取适量的孔雀石绿、结晶紫标准品，用乙睛分别配制成100ug/mL的标准 贮备液。 100mL容量瓶中，用乙睛稀释至刻度，配制成1μg/mL的混合标准中间溶液。一18℃避光保存 （4.9）0.40mL，用乙睛准确稀释至2.00mL，配制适当浓度的混合标准工作液。 5仪器与设备 5.1 高效液相色谱仪：配荧光检测器。 5.2匀浆机。 5.3离心机：4000r/min。 5.4旋涡振荡器。 5.5固相萃取装置。 5.6旋转蒸发仪。 6样品制备 6.1取样 鱼去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；虾去头、壳、肠腺，取肌肉部分；蟹、甲鱼等取可食部分。样品切为 不大于0.5cmX0.5cm×0.5cm的小块后混合。 6.2提取 称取5.00g样品于50mL离心管内，加入10mL乙睛，10000r/min匀浆提取30s，加入5g酸性 氧化铝，振荡2min，4000r/min离心10min，上清液转移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加人 2mL二甘醇，3mL硼氢化钾溶液（4.10），振摇2min。 另取50mL离心管加人10mL乙睛，洗涤匀浆机刀头10s，洗涤液移入前一离心管中，加入3mL 硼氢化钾溶液（4.10），用玻棒捣散离心管中的沉淀并搅匀，漩涡混匀器上振荡1min，静置20min， 4000r/min离心10min，上清液并人125mL分液漏斗中。 在50mL离心管中继续加入1.5mL盐酸羟胺溶液（4.11）2.5mL对-甲苯磺酸溶液（4.12） 5.0mL乙酸铵缓冲溶液（4.14），振荡2min，再加人10mL乙睛，继续振荡2min，4000r/min离心 10min，上清液并入125mL分液漏斗中，重复上述操作一次。 在分液漏斗中加人20mL二氯甲烷，具塞，剧烈振摇2min，静置分层，将下层溶液转移至250mL 茄形瓶中，继续在分液漏斗中加入5mL乙腈、10mL二氯甲烷，振摇2min，把全部溶液转移至50mL 离心管，4000r/min离心10min，下层溶液合并至250mL茄形瓶，45℃C旋转蒸发至近干，用2.5mL乙 睛溶解残渣。 6.3净化 将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端连接酸性氧化铝固相萃取柱，用5mL乙活化，转移提取 真空的情况下，加入3mL等体积混合的乙睛和乙酸铵溶液（4.13），收集洗脱液，乙睛定容至3mL，过 0.45μm滤膜，供液相色谱测定。 7测定 7.1色谱条件 7.1.1色谱柱：ODS-Cis柱,250mmX4.6mm(内径）,粒度5μm。 2 SAC GB/T203612006 7.1.2流动相：乙睛十乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L，pH4.5）=80十20。 7.1.3流速:1.3mL/min。 7.1.4柱温：35℃。 7.1.5激发波长：265nm。 7.1.6发射波长：360nm。 7.1.7进样量：20μL。 7.2色谱分析 分别注入20μL孔雀石绿和结晶紫混合标准工作溶液及样品提取液于液相色谱仪中，按上述色谱 条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准品的保留时间定 性，外标法定量。标准品色谱图参见附录A。 8结果 8.1 计算 样品中孔雀石绿和结晶紫的残留量按式（1)计算。 AXc,XV X= :(1) A,Xm 式中： X—样品中待测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 待测组分标准工作液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； Cs- A一样品中待测组分的峰面积； A,—待测组分标准工作液的峰面积； V——样液最终定容体积，单位为毫升（mL)； 样品质量，单位为克（g）。 8.2线性范围 孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的线性范围：0.1ng/mL～600ng/mL。 8.3检出限 本方法孔雀石绿、结晶紫的检出限均为0.5μg/kg。 8.4回收率 在样品中添加0.4ug/kg~100μg/kg孔雀石绿时，回收率为70%~110%。 在样品中添加0.4ug/kg~100ug/kg结晶紫时，回收率为70%~110%。 8.5重复性 本方法的相对标准偏差<15%。