ICS 65.120 B 20 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T201962006 饲料中盐霉素的测定 Determination of salinomycin in feeds 2006-02-24发布 2006-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T20196—2006 前言 本标准在查阅国内外文献基础上，提出饲料中盐霉素测定的两种方法， 第一法为微生物检验法（仲裁法），微生物检验方法主要参考了我国原进出口商品检验局 《畜、水产食品中的残留物质检验方法》中盐霉素残留量检测方法制定的。其方法原理、微生物检定操作 步骤基本相同，方法的范围、称样量、试样提取条件进行了改进，改进技术内容如下： 将提取液由甲醇，四氯化碳分离提取改为用甲醇和水直接提取； 由先过硅胶柱再过氧化铝层析柱净化改为直接用氧化铝层析柱净化 第二法为高效液相色谱柱前衍生化法，参考《JournalofChromatographyA》1999报导《高效液相色 谱柱前衍生化法测定动物饲料中拉沙里霉素、莫能霉素、盐霉素、甲基盐霉素》制定。其方法原理、基本 操作步骤相同，方法的范围、试样称样量根据试验进行了改进，改进技术内容如下： 本标准范围适用于配合饲料、浓缩饲料、预混合饲料、盐霉素预混剂，较文献扩大； 本标准称样量、盐霉素提取液稀释度见附录A。 以上两种方法均增加了“重复性”。 本标准的附录B、附录C为规范性附录，附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（武汉）。 本标准起草人：刘小敏、张勇、高利红、何一帆。 GB/T20196—2006 饲料中盐霉素的测定 1范围 本标准规定了饲料中盐霉素的微生物检验方法和高效液相色谱仪柱前衍生化检验方法 本标准两种方法均适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中盐霉素的测定。最低检出限为 1.25mg/kg。其微生物检验方法为仲裁法。本标准高效液相色谱柱前衍生化法也适用于盐霉素预混 剂中盐霉素的测定。 注1：1000盐霉素单位（U)相当于1mg的盐霉素（C2H%Om）。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件.其最新版本活用干本标准 GB/T4789.1食品卫生微生物学检验总则 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 3方法1：微生物检验方法（仲裁法） 3.1原理 用甲醇和水提取试样中盐霉素，提取液过氧化铝层析柱净化，除去饲料中的干扰性物质。洗脱液经 稀释（或浓缩），利用试液中盐霉素与嗜热脂肪芽孢杆菌作用产生抑菌圈，根据抑菌圈大小用标准曲线法 定量测定盐霉素含量。 3.2试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 3.2.1甲醇溶液 9+1(V+V)。 3.2.2氧化铝 270目~335目：经300℃活化3h，于干燥器冷却备用。 3.2.3氧化铝层析柱 将活化氧化铝装填人层析柱中（高20mm，内径10mm），同时轻轻拍柱至氧化铝表面不再下降。 氧化铝的高度为8cm～9cm。 3.2.4试验菌种 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilusvar.calidolactis）。 3.2.5盐霉素标准溶液 3.2.5.1盐霉素标准贮备溶液 度，摇匀，其浓度为1000μg/mL，置于0℃冰箱中，有效期两周。 3.2.5.2盐霉素标准中间液 准确移取10.00mL标准贮备液（3.2.5.1）于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，其浓度 分别为100.0μg/mL。当日配制和使用。 1 GB/T 20196—2006 3.2.5.3盐霉素标准工作溶液 分别准确移取一定量盐霉素中间液（3.2.5.2），用甲醇溶液（3.2.1)稀释成浓度为5.00μg/mL、 10.00μg/mL、15.00μg/mL、20.00μg/mL、25.00μg/mL的标准工作液，其中5.00μg/mL为参考浓 度的标准工作液。以上溶液须当日配制和使用。 3.2.6培养基 按附录B中规定制备。 3.2.7菌悬浮液 嗜热脂肪芽孢杆菌接种于培养基I内，于（55土1)℃培养（17土1)h。于8000r/min离心15min， 弃去上层液。加人适量生理盐水，离心，反复洗涤，弃去洗液。最后加入30mL生理盐水制成均悬浮 液，于4℃冰箱保存，该溶液可使用6周～8周。 3.2.8检定平板的制备 在制平板前，先放上牛津杯注入0.10mL的5ug/mL浓度的标准工作液（3.2.5.3)对菌悬液的最 佳用量进行预测试。以不同量的菌悬液加入经溶化并冷却至50℃～55℃的培养基Ⅱ，充分混合，于 液用量为最佳用量。 于灭菌平Ⅲ中加入20mL熔化并冷却至50℃～55℃的培养基Ⅱ，保持水平，待其凝固后，制成基 层。再注入已加入最佳用量菌悬液的培养基Ⅱ，保持水平，使其凝固制成检定平板，所用平板需当天 制备。 3.3仪器与设备1) 3.3.1高压灭菌锅或灭菌箱， 3.3.2恒温培养箱：55℃士1℃，隔板保持水平。 3.3.3旋转真空蒸发器。 3.3.4振荡器：往复式。 3.3.5离心机：不低于7000g（9000r/min）。 3.3.6游标卡尺：测量范围0mm~200mm，精度0.02mm；或抑菌圈测量仪 3.3.7培养皿：内径90mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。 3.3.8牛津杯：内径6.0mm，高10.0mm，外径7.8mm的不锈钢管。 3.3.9可调微量移液器：200μL~1000μL。 注2：可调微量移液器需经过校准。 3.3.10实验室常用玻璃器皿。 3.4试样的制备 按GB/T14699.1饲料采样方法采样，选取饲料样品至少500g，四分法缩减至少100g，磨碎，通过 0.28μm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用。 3.5分析步骤 3.5.1试液制备 3.5.1.1微生物实验室的操作注意事项按GB4789.1执行。 3.5.1.2准确称取一定量试样，精确至0.0001g，于250mL具塞三角瓶中，准确加入20.0mL样品 提取液（3.2.1），在往复振荡器上振荡1h，静置片刻，全部转移到准备好的氧化铝柱（3.2.3)中，用样品 提取液（3.2.1）不间断地洗脱。用100mL容量瓶接收至刻度。 3.5.1.3根据提取液（3.5.1.2)中盐霉素预计浓度（依据标示量、称样量和提取液量确定分取量，参见 附录A)吸取一定量提取液（3.5.1.2)置于旋转蒸发器中，减压至干。加入适量样品提取液（3.2.1)稀 1）可以用一次性使用的仪器代替可重复使用的仪器 2 GB/T 20196—2006 释，使试液中盐霉素含量为5μg/mL~20ug/mL 3.5.2标准曲线的制备 以5.0μg/mL浓度的标准工作液作为参考浓度。标准曲线上的每个标准浓度各取3个检定平板 为一组。在每个平板上放置6个牛津杯，使牛津杯在半径为28mm的圆面上成60°角间距。其中3个 准浓度溶液要间隔放置。4种浓度的标准工作液共用12个检定平板。 将陶瓦盖盖好，于4℃放置1h～2h后，在（55士1)℃培养（17士1)h。除去牛津杯。精确地测量所 产生的抑菌斑（精确到0.1mm）。求出每组3个检定平板上5.0μg/mL浓度的抑菌斑直径读数（B)与 径读数的平均值（B'）。用36个参考浓度抑菌斑直径的平均值（B'）与每组中9个参考浓度抑菌斑直径 平均值（B)之差来校正其他各浓度标准工作液的抑菌斑读数的平均值（A'）。 以溶液浓度为横坐标，该溶液被校正后的抑菌斑的直径（A）为纵坐标，绘制标准曲线图或计算回 归方程。 校正按式(1)计算： A'=B-B+A .(1) 式中： A被校正后的抑菌斑直径读数，单位为毫米（mm）； B标准对照溶液抑菌斑直径读数总平均值，单位为毫米（mm）； B被校正溶液组内的标准对照溶液抑菌斑平均读数，单位为毫米（mm）； A一—被校正溶液的抑菌斑直径的平均读数，单位为毫米（mm）。 3.5.3测定 60°角间距。其中3个牛津杯滴加0.1mL样液，另3个滴加0.1mL参考浓度（5.00μg/mL）的标准工 作液，样液与参考浓度标准工作液要间隔放置。将陶瓦盖盖好，于4℃放置1h～2h后，在（55土1）℃培 养（17士1)h。除去牛津杯。精确地测量所产生的抑菌斑的直径（精确到0.1mm）。校正后，求其平 均值。 3.6结果计算 3.6.1如样液呈现抑菌圈直径小于12mm，即报告为“阴性”。 如样液呈现抑菌圈直径平均值大于等于12mm，经校正后，从标准曲线上查出（或计算出）相应盐 霉素的浓度，再按式（2)计算试样中盐霉素含量。 如测定结果为阳性，即所显抑菌圈直径平均值大于等于12mm，必要时，尚需进行确证试验（可用 生物自显影法，参见附录C)，以证明抑菌物确系盐霉素。 3.6.2饲料中盐霉素含量按式(2)计算： cXn w= .(2) m 式中： SAC 试样中盐霉素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c—从标准曲线上查出的试样液中盐霉素浓度，单位为毫克每千克（mg/kg）； n稀释倍数； m——称取试样的质量，单位为克（g）。 3.6.3平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。 3.7重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值的绝对差值