ICS 65.120 B 20 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T20191—2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验 Microbiological examination of Lactobacillus acidlophilus in feeds 2006-05-17发布 2006-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 20191—2006 前言 本方法主要参考GB/T16347一1996《乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验》，结合我国饲料中允 许使用的乳酸菌的种类，以及参考乳酸菌的分类鉴定过程制定的 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（北京）。 本标准主要起草人.饶正华、李丽蓓、杨曙明、苏晓鸥 GB/T20191—2006 饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验 1 范围 本标准规定了饲料中嗜酸乳杆菌数的测定及鉴定方法 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T14699.1饲料采样 3设备和材料 3.1恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2冰箱：0℃~4℃。 3.3 恒温水浴：46℃±1℃。 3.4 电炉：可调式。 3.5 吸管：容量为1mL、10mL、25mL。 3.6广口瓶或三角瓶：容量为500mL。 3.7 平皿：直径为9cm。 3. 8 试管：18mmX180mm。 3.9 显微镜：400倍。 3. 10 高压灭菌锅：使用温度为121℃。 烘箱：使用温度为160℃。 3.11 SAG 4培养基和试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂、蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 4. 1 改良MC培养基（modifiedchalmers培养基）（见第A.1章）。 4.2氯化钠。 4.3 革兰氏染色液（见第A.6章）。 4.4 3%过氧化氢溶液。 4.5 靛基质试剂（见第A,4章）。 4. 6 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂。 4.7 明胶培养基（见第A.5章）。 4.8 乳酸杆菌糖发酵管（见第A.2章）。 4. 9 七叶苷培养基（见第A.3章）。 5采样与试样制备 5.1 采样工具，如探子、铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的 5.2 样品包装为袋、瓶或罐装者，取完整未开封的。样品是固体粉末，应边取边混合；样品是流体，通过 1 GB/T20191—2006 振摇即可混匀。样品送到微生物检验室应越快越好，一般应不超过3h。如果路途遥远，可将试样于 0℃～5℃中保存（如冰壶）。 5.3采样数量和方式按GB/T14699.1执行。 6嗜酸乳杆菌数的测定 6.1检验程序 嗜酸乳杆菌数检验程序如图1： 配成儿个适当倍数闷稀释液 选择2个～3个适当稀释度，各以1ml显加入灭平而内 + 每Ⅲ内加入适量改良MC培养 36℃±1℃ 72 h±1 h 菌落计数、鉴定 报告 图1嗜酸乳杆菌数检验程序 6.2操作步骤 6.2.1以无菌操作将经过充分摇匀的试料25g（或25mL）放入含有225mL灭菌生理盐水（见第A.7 章）的灭菌广口瓶内配成1：10的均匀稀释液。 6.2.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水（见第 A.7章）的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。 6.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL 灭菌吸管。 6.2.4选择2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移 1mL稀释液于灭菌平Ⅲ（3.7）内，每个稀释度作两个平Ⅲ。 6.2.5稀释液移人平皿后，应即时将冷至50℃的改良MC培养基（4.1)注人平皿约15mL，并转动平 对照，以上整个操作自培养物加人培养皿开始至接种结束须在20min内完成 6.2.6待培养基凝固后，翻转平板，置36℃士1℃恒温培养箱（3.1)内培养72h士1h取出，观察菌落特 征，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数。 6.3菌落特征 嗜酸乳杆菌在改良MC培养基（4.1)上菌落生长形态特征见表1。 2 GB/T 20191—2006 表1嗜酸乳杆菌在改良MC培养基上的菌落特征 菌种类型 菌落特征 杆菌 平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2mm土1mm，可有淡淡的晕 嗜酸乳杆菌的鉴定 7.1菌种制备：自平板上挑取单菌落，接种于改良MC培养基（4.1）斜面，于36℃士1℃，24h～48h培 养，刮取菌苔，分别进行下列试验。 7.2进行革兰氏染色，显微镜（3.9）检查，并做过氧化氢酶试验。嗜酸乳杆菌应为革兰氏阳性，无芽孢， 过氧化氢酶阴性的杆菌。进一步鉴定需做硝酸盐还原、明胶液化、产靛基质、产硫化氢和碳水化合物发 酵试验。嗜酸乳杆菌极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。 7.3嗜酸乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果及其与干酪乳杆菌和植物乳杆菌的区别，见表2。 表2# 饲料中常用乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果 菌种名称 七叶苔 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 棉籽糖 煎糖 嗜酸乳杆菌 + + + + 一 P + 干酪乳杆菌 + + d + + P 植物乳杆菌 + + + + + + 注 1: + 阳性； 阴性； d—有些菌株阳性,有些菌株阴性 注2：本表中列出干酪乳杆菌与植物乳杆菌的碳水化合物发酵是为了与饲料中允许使用的其他乳杆菌相区别。 嗜酸乳杆菌与二者碳水化合物发酵试验的主要区别在于甘露醇和山梨醇试验。 8结果计算及表述 菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定（见第7章），根据证实为嗜酸乳杆菌菌落数计算出该皿内 的此菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中此菌数，按式（1)计算： A=BX XJ (1) 5 式中： A一一测定的嗜酸乳杆菌菌落数，单位为菌落形成单位每克（cfu/g)或菌落形成单位每毫升（(cfu/mL)； B一嗜酸乳杆菌的可疑菌落总数； C——5个鉴定的菌落中确认为嗜酸乳杆菌的菌落数； f一稀释倍数。 例如含有嗜酸乳杆菌的试料中10-6稀释液在改良MC培养基平板上，生成的嗜酸乳杆菌可疑菌落 为100个，取5个鉴定，证实为嗜酸乳杆菌的是4个，则由1g试料中含嗜酸乳杆菌菌数为：100X- 106=8.0X107。