ICS 65.120 B 46 中华人民共和国国家标准 GB/T19539—2004 饲料中赭曲霉毒素A的测定 Determination of ochratoxin A in feeds 2004-06-10发布 2004-10-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19539—2004 前言 中赭曲霉毒素A的测定》中薄层色谱方法和卫生部食品卫生监督检验所建立的酶联免疫吸附法。本标 准规定以薄层色谱法为仲裁方法，酶联免疫吸附测定法为快速筛选法 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。 本标准由江苏省微生物研究所负责起草 本标准主要起草人：宓晓黎、袁建兴、李利东、丁贵平、成恒嵩。 I GB/T19539—2004 饲料中赭曲霉毒素A的测定 1 范围 本标准规定了曲霉毒素A（OchratoxinA，以下简称OA)的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测 定方法。 本标准适用于配合饲料、饲用谷物原料中OA的测定 薄层色谱测定方法的最低检测量为2ng，酶联免疫吸附测定方法的最低检测量为0.05ng。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样方法 3薄层色谱法（仲裁法） 3.1原理 试样中的OA经提取、液-液分配萃取、浓缩，然后进行薄层分离，限量定量，或用薄层扫描仪测定荧 光斑点的荧光强度，外标法定量。 3.2试剂与材料 所用试剂除另有规定，均使用分析纯试剂。水符合GB/T6682中一级水的规定。 3.2.1石油醚。 3.2.2甲醇溶液（55十45）。 3.2.3三氯甲烷。 3.2.4苯-冰乙酸（99+1）。 3.2.5 40g/L氯化钠溶液 3.2.6无水硫酸钠：650℃灼烧4h，冷却后贮于干燥器中备用 3.2.7 展开剂（用时选择一种）： 甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6+3+1.2+0.06）； b) 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6+3+1.4）； 苯-冰乙酸（9+1）。 3.2.8显色剂：碳酸氢钠乙醇溶液（在100mL水中溶解6.0g碳酸氢钠，加20mL乙醇）。 3.2.9薄层板：称取4g硅胶G加约10mL0.5%羧甲基纤维素钠水溶液于乳钵中研磨至糊状。立即 倒人涂布器内制成10cm×20cm、厚度0.3mm的薄层板，在空气中干燥后，用甲醇预展薄层板，除去 杂质，吹干，在105℃～110℃活化1h，置于干燥器内保存备用。 3.2.10OA标准储备溶液： 警告： 1凡接触OA的容器，需浸入4%次氯酸钠（NaOCI)溶液，半天后清洗备用。 2为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。 称取适量的OA标准品，用苯-冰乙酸（3.2.4）配制成约10μg/mLOA贮备液。贮备液置于4℃冰 GB/T19539—2004 箱中避光保存。 标定贮备液的浓度，用1cm石英比色杯，以苯-冰乙酸（3.2.4）为参比，在OA的最大吸收峰波长 333nm处，测定吸光度值A。储备液中OA的含量（X，）以微克每毫升（μg/mL）表示，按式（1)计算。 式中： A一测定的吸光度值； M—OA的摩尔质量（M=403g/mol)； e——OA在苯-冰乙酸中的分子吸收系数（e=555m/mol)； 一一比色杯的光径长度，单位为厘米（cm）。 3.2.11OA标准工作溶液：根据计算的OA标准储备液的浓度，精密吸取标准储备液（3.2.10）适量， 用苯稀释成浓度为1.0μg/mL的标准工作溶液。 3.3仪器与设备 3.3.1小型粉碎机。 3.3.2电动振荡器。 3.3.3薄层板涂布器。 3.3.4玻璃器皿：分液漏斗、蒸发血、浓缩瓶。所有玻璃器血均需用稀盐酸浸泡，依次用自来水、蒸馏水 冲洗。 3.3.5 快速定性滤纸。 3.3.6展开槽：250mmX150mmX50mm（立式，具磨口）。 3.3.7紫外光灯：波长365nm。 3.3.8点样器：1μL~99μL。 3.3.9薄层扫描仪：配有汞灯光源。 3.4试样制备 按GB/T14699.1饲料采样方法取得试样，四分法浓缩减取约200g，经粉碎，混匀，装入磨口瓶中 备用。 3.5分析步骤 3.5.1试样处理 称取约20g试样（3.4）（精确至0.01g），置于200mL具塞锥形瓶中，加30mL石油醚和100ml 甲醇溶液（3.2.2），瓶塞盖紧。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待分层后，放出甲醇 水层20mL，置于100mL分液漏斗中，用pH试纸测试，一般为5～~6。加入25mL三氯甲烷，振摇 2min，静置分层后，放出三氯甲烷层于另一个分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇水 层（在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促使其分层），将三氯甲烷层合并于同一分 液漏斗中，加入50mL～100mL氯化钠溶液（3.2.5），振摇，放置分层后，将三氯甲烷层放出，经装有约 20g无水硫酸钠的玻璃漏斗流人蒸发皿中，将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次 残渣，摇匀，供薄层色谱点样用。 3.5.2点样 在距薄层板下端1.5cm～2cm的基线上，以1cm的间距，用点样器依次点标准工作溶液（3.2.11） 2μL、4μL、7μL、10μL(相当于2ng、4ng、7ng、10ng）和试样液（3.5.1)20μL。 3.5.3展开 将薄层板放人有展开剂的展开槽中，展至离原点13cm15cm，取出，吹干。 3.5.4观察与确证 将展开后的薄层板置于波长365nm紫外光灯下，观察与OA标准点（4ng）比移值相同处的试样的 2 GB/T19539—2004 蓝绿色荧光点。若相同位置上未出现荧光点，则试样中的OA含量在本测定方法的最低检测量 100ug/kg以下。如果相同位置上出现荧光点，用显色剂对准各荧光点进行喷雾后吹干，观察荧光点由 蓝绿色变为蓝紫色且荧光强度明显加强可确证试样中含有OA。于荧光点下方用铅笔标记，待扫描定 量测定。 3.5.5定量测定 3.5.5.1薄层扫描工作条件 光源：高压汞灯； 激发波长：365nm； 发射波长：450nm； 检测方式：反射； 狭缝：可根据斑点大小进行调节； 扫描方式：距齿扫描， 3.5.5.2标准曲线绘制 以OA标准工作溶液质量（ng）为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。 3.6结果计算和表述 根据试样液荧光斑点峰面积扫描积分值从标准曲线上查出对应的OA质量（ng），试样中OA的含 量（X）以微克每千克（μg/kg）表示，按式（2）计算。 X=miXVi moX Vz 式中： Vi——试样液（3.5.1)最后定容体积，单位为微升（μL）； V，—试样液点样体积，单位为微升（μL)； mi一一从标准曲线上查得试样液点上对应的OA的质量，单位为纳克（ng）； mo—最后提取液相当试样的质量，单位为克（g）。 计算结果表示到小数点后一位有效数字。 3.7重复性 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不大于10%。 4酶联免疫吸附测定法（快速筛选法） 4.1原理 方法的检测依据是抗原-抗体反应。将OA抗体的羊抗体吸附在固相载体表面，加人OA抗体、酶 OA结合物与结合在固体表面OA抗体竞争，未结合的酶标OA结合物洗涤除去。加人酶底物，在结合 酶的催化作用下，无色底物降解产生有蓝色物质。加入终止剂后颜色转变为黄色。通过酶标检测仪，在 450nm波长处测吸收值。吸光强度与试样中OA的浓度成反比 酶联免疫吸附测定法具有操作简单，快速灵敏，结果可靠的特点。目前有专门测定OA的酶联免疫 检测试剂盒的商品。在分析时适当参考操作说明书。 4.2试剂与材料 4.2.1包被抗体的聚苯乙烯微量反应板24孔或48孔。 4.2.270%甲醇溶液 4.2.3OA标准溶液：精密吸取标定后的标准储备液（3.2.10)适量，用甲醇溶液（4.2.2）配制成OA标 准溶液1~5,浓度分别为0μg/L、1μg/L、2μg/L、4μg/L、8μg/L。 4.2.4酶标抗原溶液：OA与辣根过氧化酶结合物。 3