ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of avian influenza virus subtype H5 2004-02-15实施 2004-02-14发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T19438.2—2004 前言 GB/119438—2004 《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分： GB/T19438.1—2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.2—2004 《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； —GB/T19438.3—2004 《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》； GB/T19438.4—2004 《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。 本部分的附录A是资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本部分主要起草人：刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。 GB/T19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本部分规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T19438.1—2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 3缩略语 下列缩略语适用于本部分。 3. 1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 3.2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.3 RNA 核糖核酸。 3. 4 TaqDNA聚合酶。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水， 3. 6 DEPC 焦碳酸乙二酯。 4原理 采用TaqMan方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血 凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段 内部。其中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光 基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和 探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧 光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5→3的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的 GB/T19438.2—2004 R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR 产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 5试剂和材料 5.1试剂 除另有说明，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无RNA酶的容器（用DEPC水处理后高压灭菌） 分装。 5.1.1三氯甲烷。 5.1.2异丙醇：一20℃预冷。 5.1.375%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷 5.1.40.01mol/L(pH7.2)的PBS:配方见GB/T19438.1-2004中附录A。121℃±2℃,15min高 压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000IU/mL。 5.1.5H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒"：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附 录A。 5.2仪器设备 5.2.1高速台式冷冻离心机：最大离心力12000r/min以上。 5.2.2荧光PCR检测仪、计算机。 5.2.32℃～4℃冰箱和一20℃C冰箱 5.2.5组织匀浆器。 5.2.6混匀器。 5.2.7可移动紫外灯。 6样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 6.1取样工具 下列取样工具必须经121℃±2℃，15min高压灭菌或经160℃土2℃干烤2h。 拭子； 剪、镊； 一研钵； -Eppendorf管(1.5mL) 6.2采样方法 6.2.1活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，具体采集方法如下： 一咽喉拭子，采取时要将子深入喉头及上聘裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液； 一取泄殖腔拭子时，将子深人泄殖腔转一圈沾取粪便； 一将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放人盛有1.0mLPBS的Eppendorf管中，编号备用。 6.2.2内脏或肌肉样品 用无菌镊剪夹取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mLPBS混匀，或置于组织匀浆器中， 加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中3000r/min离心10min，取上清液转 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T19438.2—2004 人Eppendorf管中，编号备用。 6.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 6.3存放与运送 采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应 避免反复冻融（最多冻融三次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实 验室。 7操作方法 7.1实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C 7.2样本的处理 在样本处理区进行。 7.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和， 对每个管进行编号。 7.2.2每管加人600uL裂解液，然后分别加人待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL，吸头反复吸 打混勾（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL三氯甲烷，混匀器上震荡混匀5s（不宜过于强烈，以免 产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。于4℃条件下，12000r/min离心15min。 7.2.3取与7.2.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendorf管，加人400μL异丙醇（一20℃预冷），对每 个管进行编号。吸取7.2.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500μL，注意 不要吸出中间层，颠倒混匀。 7.2.412000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液， 倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。 7.2.5于4℃C条件下，12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻 轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。 7.2.64000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩 到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥 3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。 7.2.7加人11uLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提 取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于一70C冰箱。 7.3扩增试剂准备与配置 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出AIVH5亚型RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。 设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，每个样本测试反应体系 配制见表1。 表1测试反应体系配制表 试剂 RT-PCR反应液/μL Taq酶/μL 用量 15 0.25 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加人0.25×n颗RT-PCR酶颗粒，充分混 合均勾，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区 7.4加样 在样本处理区进行。在各设定的PCR管中分别加人7.2.7中制备的RNA溶液各10μL，盖紧管 3